环磷酰胺致小鼠生精障碍作用研究

陈指龙，张晓春，薛立群，杨 青

(湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128)



环磷酰胺致小鼠生精障碍作用研究

陈指龙，张晓春，薛立群，杨 青*

(湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128)

为探讨不同剂量环磷酰胺作用不同时间后诱导小鼠生精障碍的作用，将80只雄性ICR系小鼠随机分成20、40、80 mg/kg体重环磷酰胺(CTX)处理组和生理盐水对照组，腹腔注射5 d，每2 d称重1次，2周和4周后分批检测睾丸指数、附睾指数、精子数和精子畸形率，并结合HE染色检测睾丸组织结构变化。结果显示，作用2周时，高剂量的CTX显著影响体重增长，而中低剂量组只有处理后短时间体重降低明显；睾丸的生精指数变化均不显著，但其组织结构发生不同程度的病理变化。作用4周时，只有高剂量组对体重产生显著的作用；生精指数包括睾丸指数、精子数以及精子畸形率，3个组与对照相比均表现出明显差异；睾丸发生病理学病变的程度随剂量的增加而更加明显。采用40 mg/kg CTX腹腔注射5 d，作用4周后能建立较为理想的小鼠生精障碍模型。

环磷酰胺；生精障碍；睾丸；小鼠

环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)作为一种免疫抑制药物，它对睾丸的形态和精子的生成有一定损害，近年来已被广泛用于构建小鼠生精障碍模型，但在使用剂量和作用时间方面还需更多地探究。环磷酰胺是一种细胞毒性药物，在体外无生物活性，其毒性主要表现在对活化增殖细胞的影响。研究发现环磷酰胺对人的生殖和动物繁殖均有影响，不仅对生育力有明显损害，对生殖系统也有潜在致畸危险，它能杀死有丝分裂和进入循环周期的细胞；也具有较强的免疫抑制作用，主要体现在细胞免疫和体液免疫上[1-2]。有研究表明，无论是灌胃还是腹腔注射，环磷酰胺均引起小鼠较为严重的免疫抑制，并且在一定范围内，与时间和剂量成正相关[3-4]。本研究通过不同剂量的环磷酰胺对小鼠进行腹腔注射，观察其在不同时间对小鼠生精障碍的影响，旨在为短期构建小鼠生精障碍模型提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 环磷酰胺，Sigma公司产品；无水乙醚，国药集团化学试剂有限公司产品；龙胆紫溶液，中杉金桥生物技术有限公司产品；Bouin's液(苦味酸溶液∶甲醛∶冰醋酸按体积比15∶5∶1配制)；其他均为国产试剂。

1.1.2 实验动物 4周龄ICR系雄性小鼠，体重20 g左右，SPF级，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。常规小鼠饲养，饲养环境安静，温度25℃±2℃，自由摄食和饮水。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及处理 80只小鼠随机分为4组，分别为对照组、环磷酰胺低剂量组(CTX-L,20 mg/kg)、环磷酰胺中剂量组(CTX-M,40 mg/kg)以及环磷酰胺高剂量组(CTX-H,80 mg/kg)， 每组20只。小鼠适应性饲喂3 d后，试验组分别腹腔注射不同剂量的环磷酰胺，每天1次，连续5 d；对照组注射等体积生理盐水。

1.2.2 体重、睾丸和附睾指数 试验过程中每天记录小鼠饮食，活动以及被毛情况，每2天称重1次。环磷酰胺处理结束后继续饲喂2周或4周，用乙醚麻醉后脱颈处死。打开腹腔取出睾丸和附睾称重，按与体重的比值计算脏器指数。

1.2.3 精子密度及精子畸形率 将左侧附睾置于1 mL PBS中，用眼科剪成分剪碎，用移液枪轻轻吹打，置于37℃培养箱中孵育20 min，使精子成分游出。将精子悬液按适当比例稀释，取10 μL于细胞计数板计数获得精子密度。另外，取20 μL精子悬液于载波片上进行抹片，自然晾干后用苏木精染液染色3 min，流水冲洗1 min，空气中干燥。在光学显微镜下观察精子形态，每个抹片观察5个视野，每个视野确保精子总数超过100个计算，根据畸形精子的数量计算精子畸形率。

1.2.4 睾丸组织形态学变化 睾丸称重后将右侧睾丸置于Bouin's液中固定，常规脱水，石蜡包埋，切片后脱蜡进行HE染色，显微镜下观察其组织形态学结构。

1.2.5 数据分析 试验数据采用Spasssatistics软件进行ONE-WAY ANOVA分析，数值以平均数±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 环磷酰胺对小鼠体重、睾丸和附睾指数的影响

环磷酰胺处理后，活动和饮食减少，被毛无光泽，试验过程中无死亡。体重记录显示，环磷酰胺处理4 d后，高剂量组(80 mg/kg)体重显著低于对照组(P<0.01)；在第6天时，3个剂量环磷酰胺处理的小鼠体重均显著低于对照组，随后至处理第12 d时，只有高剂量组小鼠体重明显低于对照组(图1)。而当环磷酰胺处理4周后，也只有高剂量组小鼠体重比对照组显著降低(P<0.01)，其余各组间无显著差异。

** 表示与对照组比较差异极显著，P<0.01

环磷酰胺对睾丸和附睾指数的影响见表1。结果显示：当环磷酰胺处理2周时，其睾丸和附睾指数与对照组相比均无显著差异；而至4周时，环磷酰胺各处理组与对照组相比，睾丸指数显示降低，且呈剂量依赖性；附睾指数没有差异。

表1 环磷酰胺对小鼠睾丸和附睾指数的影响

注：数据显示平均值±标准差，n=10；*表示P<0.05，**P<0.01。

Note:Data display as mean±SD,n=10; * meansP<0.05,and **P<0.01.

2.2 环磷酰胺处理对精子及其畸形率的影响

环磷酰胺处理2周后，虽然精子数相对于对照有下降趋势，但无显著性差异(结果未显示)。当处理4周后，与对照组相比，3个试验组的精子数均显著降低，其中低剂量组P<0.05，高剂量和中剂量组P<0.01。高剂量组精子畸形率显著高于对照组，而低剂量和中剂量组与对照差异不显著(P>0.05)(表2)。

2.3 环磷酰胺处理对睾丸组织形态学的影响

正常对照组睾丸组织中其生精小管连接紧密，基膜完整，管腔饱满，界膜清晰，睾丸间质细胞排列有序，结缔组织血管丰富，生精细胞厚度适中，精子细胞丰富，管腔液较多(图2 A和E)。当CTX处理2周后，低剂量和中剂量处理使睾丸组织形态学发生一定的变化，主要表现为生精细胞间的连接不紧密(图2 B和C)；而高浓度的环磷酰胺导致明显病变，主要表现为生精上皮较薄，基膜破裂，生精细胞松散、连接疏松，腔内空腔较大，无管腔液(图2 C)。当用CTX处理4周时，各剂量处理组对睾丸的组织结构均表现出不同程度的损伤。低剂量组表现为生精上皮变薄，生精细胞连接不紧密，生精细胞层数适中，可见排列整齐的精子细胞，管腔内有一定数量精子(图2 F)；中剂量组睾丸中上皮变薄，生精细胞层数减少，细胞连接不紧密，成熟精子细胞数量较少，管腔内可见少量精子(图2 G)；而高剂量的环磷酰胺导致生精小管变形，有些甚至塌陷，生精上皮明显变薄，基膜破裂，生精细胞脱落，生精细胞层数明显减少，无精子细胞，管腔内无精子，睾丸间质细胞变少，连接不紧密(图2 H)。

表2 环磷酰胺对小鼠精子数和精子畸形率的影响

注：数据显示平均值±标准差，n=10；*P<0.05，**P<0.01。

Note:Data display as mean±SD,n=10; *P<0.05, **P<0.01.

A和E：对照组；B和F：20 mg/kg CTX；C和G：40 mg/kg CTX；D和H：80 mg/kg CTX。BV：血管；LC：间质细胞；LP：基膜；SC：精母细胞；SG：精原细胞；SP：精细胞

3 讨论

环磷酰胺作为一种应用较为广泛的烷化剂类抗肿瘤药，常用于治疗多种肿瘤、狼疮性肾炎等疾病，但由于它可与DNA发生交叉联结而抑制DNA的合成，产生较大的毒副作用。在雌性生殖系统中，一定剂量的环磷酰胺对卵泡发育产生一定毒副作用而影响动物的妊娠[1,5]；而在雄性动物中，一定剂量的环磷酰胺可抑制精原干细胞的增殖和分化，使生精细胞减少、生精细胞凋亡、睾丸氧化应激损伤、睾酮合成障碍，损伤生殖细胞遗传物质，损害支持细胞功能等[6-9]。因此，在一些生殖毒性相关的毒理学安全试验评价中，常以环磷酰胺作阳性参照物[2,5]。

研究环磷酰胺致小鼠睾丸染色体畸变的试验中，阮海星等[10]用常规推荐的环磷酰胺剂量40 mg/kg体重处理小鼠发现有动物发生死亡，对初级精母细胞染色体畸变试验不理想，而且对骨髓造血系统有一定损伤。本研究中，使用该剂量或更大剂量的环磷酰胺连续处理5 d后，继续观察2周或4周均未导致实验动物的死亡，但对体重增长有明显的影响，这可能是由于动物品系不同导致一定的偏差。

据Elangovan N等[11]研究用50 mg/kg体重至200 mg/kg体重等不同剂量的环磷酰胺每周处理小鼠一次并连续处理5周，最后一次处理后的第1周或5周分别对其体重增长和生精指数进行检测，发现处理结束后只有高剂量200 mg/kg体重导致体重低于对照组；小鼠睾丸指数在处理结束的短时间内显著降低，且呈剂量依赖；另外精子活力、精子数、完整顶体率以及受精能力也出现不同程度的影响，而处理结束后5周检测时，除了高剂量组(200 mg/kg体重)外，其余各剂量处理组的以上所述的生精指数均能得以修复。Lu W P等[12-13]在研究相关药物抗氧化作用时，分别用100 mg/kg体重和15 mg/kg体重的环磷酰胺构建小鼠氧化损伤模型，同样腹腔注射连续5周，每周1次，处理结束时取得了较理想的致生精障碍效果。以上研究中环磷酰胺处理时间较长，且造成的氧化损伤能在一定的时间内得以修复，为在短时间内构建小鼠生精障碍模型，一些研究通过腹腔注射环磷酰胺5 d左右以达到损伤效果[14-15]。

环磷酰胺作为一种致突变剂，常用于雄性小鼠的显性致死性试验和精子畸变研究，早期研究表明用40 mg/kg体重剂量的环磷酰胺连续处理小鼠5 d时，能导致染色体畸形，并对机体组织和生殖系统产生毒性[16-17]。本研究摸索了连续5 d腹腔注射三种不同剂量的环磷酰胺对小鼠生精障碍的影响，从体重来看，处理结束后即第6天小鼠体重均明显降低，而随着时间的延长，只有高剂量组对体重产生显著的毒副作用，这与Elangovan N等[11]研究中所用高剂量所导致的结果一致。从相关生精指数来看，环磷酰胺处理结束后短时间对生精指数产生的作用不明显，但其睾丸组织结构已发生一些病变，特别是高浓度的环磷酰胺使得生精上皮变薄，生精细胞松散严重，基膜发生破裂以及出现较大空腔，无管腔液等。随着作用时间延长至4周时，3种剂量导致的病理变化均显著，其他生精指数包括睾丸指数和精子数都显著下降，高剂量组精子畸形率增加显著，且剂量40 mg/kg体重效果较理想。从以上结果来看，环磷酰胺短时间连续处理所致的生精障碍并没有随时间的延长而得以修复。

本研究结果表明，用环磷酰胺建立一个较理想的小鼠生精障碍模型，从体重增长、相关生精指数的变化等方面评估，用40 mg/kg体重的剂量，连续腹腔注射5 d，每天1次，处理结束后4周能产生较显著的作用，但对于其受精能力以后受精后对应母鼠的繁殖情况还需做进一步研究。该模型的建立对于抗氧化损伤药物的研发、生殖毒性以及致畸致突变等相关研究提供较理想的工具。

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Effect of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogenic Obstacles

CHEN Zhi-long，ZHANG Xiao-chun，XUE Li-qun，YANG Qing

(CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan，410128,China)

This study aimed to explore the effects of different doses of cyclophosphamide (CTX) on mouse spermatogenic obstacles.Eighty male ICR mice were randomly divided into three CTX-treated groups (20,40 and 80 mg/kg body weight (BW)) and normal saline control group with intraperitoneal injection for 5 days,weighed every 2 days.Spermatogenic indexes including testis and epididymis indexes,sperm counts and abnormality rate were recorded,and histopathological changes were checked using HE staining.The results showed that high dose of CTX significantly affected mouse body weight when treated for 2 weeks,and the medium and low doses only caused effects shortly after treatment.There is no significant difference in testicular spermatogenic indexes,but testis exhibited different degrees of pathological lesions.After treated for 4 weeks,only body weight from the high dose group significantly decreased when compared to the control.Testis index and sperm number were decreased in mice treated with CTX; testicular pathological lesions were obvious with a dose-dependent manner.Conclusion:intraperitoneal injection of CTX with a dose of 40 mg/kg BW could establish an ideal model for mouse spermatogenesis obstacles after 4 weeks.

cyclophosphamide; spermatogenic obstacle; testis; mouse

2016-08-31

国家自然科学基金项目 (31572591;31272630)；作物种质创新与资源利用重点实验室(省部共建国家重点实验室培育基地)科学基金开放项目(12KFXM02)

陈指龙(1993-)，男，江西赣州人，硕士研究生，主要从事动物繁殖研究。*通讯作者

S857.22

A

1007-5038(2017)05-0034-05