牛至油对小鼠灌胃给药的急性毒性试验

欧 锐，南旭梅，吕旭英，李 琦，于 鹏

(西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州 730070)



牛至油对小鼠灌胃给药的急性毒性试验

欧 锐，南旭梅，吕旭英，李 琦，于 鹏*

(西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州 730070)

牛至油作为一种新型动物保健药物，具有促进生长、抗菌、杀菌、增强机体免疫力等作用，然而其毒性大小尚未见报道。采用Bliss法设计，对昆明小鼠单次灌胃牛至油，测定其对小鼠半数致死量(LD50)及其95%可信限，观察7 d内小鼠的毒性反应和死亡情况，对小鼠进行剖检和组织病理学检查。结果显示，牛至油单次灌胃小鼠出现不同程度的毒性反应，包括自发活动减少、闭眼、俯卧、震颤、毛发直立、强制性-阵挛性抽搐、角弓反张等，LD50为688.33 mg/kg，95%可信限为584.33 mg/kg～806.34 mg/kg。死亡小鼠均毛发直立、个体消瘦；剖检均可见肝、肾肿大；组织病理学检查可见高剂量组肝、肾组织受损明显，肝细胞索排列紊乱，肝细胞疏松，肝血窦扩张；肾小球严重肿胀，肾小囊腔狭窄，肾小管上皮细胞有不同程度肿胀、坏死。综上所述，牛至油对小鼠单次灌胃具有一定毒性，属于低毒物质。

牛至油；急性毒性；小鼠

牛至油(oregano oil)是从天然植物牛至(Origanumvulgare)中提取的挥发油，淡黄色透明液体，由多种芳香味化合物组成，化学成分主要是百里香酚、香芹酚、γ-萜品烯和ρ-异丙甲苯等，其中百里香酚和香芹酚的抗菌活性最强[1]。牛至油作为一种新型动物保健药物，具有促进生长、抗菌、杀菌、抗氧化、促进新陈代谢、提高生产性能、增强机体免疫力等作用[2-7]，对畜禽肠道细菌(如大肠埃希菌、沙门菌、猪痢短螺旋体)引起的腹泻和痢疾有特效，且不易产生耐药性[8-9]。同时牛至油的独特香味能刺激消化道感受器，激活消化道酶的活性，促进消化，提高饲料转化率，而且无药物残留[10-12]。然而牛至油的毒性大小尚未见报道。因此本研究通过牛至油对昆明种小鼠单次灌胃给药，观察小鼠所产生的急性毒性反应，测定其对小鼠的LD50及其95%的可信限，为牛至油的安全性评价及临床研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 动物 2周龄SPF级昆明小鼠(18 g～22 g)80只，雌雄各半(雌性未产无孕)，购于甘肃中医药大学实验动物中心，动物许可证号:SYXK(甘)2015-0005。雌雄鼠分笼饲养，实验室适应性饲养7 d，观察其健康状况，所选小鼠为健康，状态良好。室内通风良好，温度保持在18℃～22℃，相对湿度在40%～70%左右，12 h自然采光，小鼠自由饮水和进食。

1.1.2 药品 牛至油主要质控成分为香芹酚和百里香酚，且香芹酚含量不低于60%，百里香酚含量不低于8%。该提取物由北京中联华康科技有限公司提供，并经高分子包被技术对植物精油进行包膜，避免牛至油在空气中被氧化和挥发的损失，加强其稳定性。

1.2 试验方法

1.2.1 供试品的配制 参照《化学药物急性毒性试验技术指导原则》[13]，经过包被的牛至油，用蒸馏水配制成系列浓度的牛至油溶液(30、23.1、17.78、13.7、10.54、8.12、6.26、4.66 mg/mL)。

1.2.2 预试验 参照《化学药物急性毒性试验技术指导原则》[13]，小鼠20 只，按预编号及体质量随机分为5 组，雌雄各半，每组4只，分别用牛至油1 200、900、700、500、300 mg/kg灌胃给药，给药体积为30 mg/kg。药后连续观察3 d。结果1 200 mg/kg剂量组4只小鼠全部死亡，死亡率为100%的最小剂量(Dm)为1 200 mg/kg，300 mg/kg剂量组4只小鼠全部存活，死亡率为0的最大剂量(Dn)为300 mg/kg。所以，确定1 200 mg/kg剂量为试验的最高剂量，300 mg/kg剂量为试验最低剂量。

1.2.3 正式试验 参照《化学药物急性毒性试验技术指导原则》[13]，小鼠60 只，将小鼠按性别及体质量分层随机分为6 组，雌雄各半，每组10 只。根据最高剂量及最低剂量的公比系数(q=0.77)设计中间剂量，剂量分别为300、546.20、710.06、923.08、1 200.00 mg/kg，分别为牛至油A～E组，另设溶媒对照组。按上述剂量灌胃给药，给药体积30 mg/kg。动物给药后，每天观察小鼠的采食、饮水、精神、死亡、被毛和自主活动等情况，连续观察7 d并记录观察结果。给药当天，至少每2 h观察1 次，然后每天上午、下午各观察小鼠1 次，详细记录小鼠出现毒性反应的时间、持续时间、恢复以及小鼠死亡时间、死亡情况、中毒症状等。对死亡小鼠及时解剖，记录病变情况。统计各组小鼠死亡数，用Bliss法(SPSS软件)计算半数致死量LD50和LD50的95%可信限[14]。在给药后第7天对所有的试验小鼠进行剖检，肉眼观察主要脏器的改变，当器官出现体积、颜色、质地等改变时，进行组织病理学检查。1.2.4 体重称量及主要脏器收集 试验过程中每天记录动物健康状况和死亡情况，及时解剖死亡个体，观察主要脏器变化；并于灌胃后1 d、4 d和7 d记录雌雄个体体重。待正式试验结束后，取对照组和最高剂量组雌雄个体，取新鲜脏器于预冷的生理盐水中漂洗、滤纸吸干，放入150 mL/L的甲醛液中固定[15]。

1.2.5 组织病理学观察 取上述固定保存的小鼠脏器，200 g/L蔗糖脱水24 h,冰冻切片(20 μm)，HE染色，光学显微镜观察。

1.3 统计学处理方法

2 结果

2.1 一般观察

300 mg/kg和546.20 mg/kg剂量组给药后当天仅见自发活动减少；710.06 mg/kg和923.08 mg/kg组给药后当天可见自发活动减少、眼睛闭合、叫声减少、毛发直立、腹部肿胀、呼吸减弱、死亡等症状；1 200.00 mg/kg剂量组小鼠给药后当天可见毛发直立、腹部肿胀、呼吸减弱、震颤、强制性-阵挛性抽搐、死亡等症状。420.15 mg/kg和546.20 mg/kg剂量组存活小鼠在给药后24 h即恢复至正常状态。表明随着牛至油剂量的增加，小鼠的毒性反应加剧且症状持续时间延长。大部分存活动物出现症状后可逐渐缓解，溶媒对照组小鼠未见异常。

2.2 动物死亡情况

300 mg/kg组给药2 d后1只雌性死亡；546.20 mg/kg组给药2 d后雌雄各死亡1只；710.06 mg/kg组给药2 d后雌雄各死亡1只；给药4 d后2雄2雌死亡；923.08 mg/kg组给药2 d后雌雄分别死亡2只，4 d后1雄2雌死亡；1 200.00 mg/kg 剂量组给药1 d后2雌3雄死亡，2 d后2雌2雄死亡，2 d后全部死亡；溶媒对照组小鼠未见异常，见表1。

表1 试验小鼠的给药情况及LD50测定结果

2.3 体质量变化

雌性小鼠给药1 d后各剂量组小鼠体重差异不显著(P>0.05)；给药4 d后1 200.00 mg/kg小鼠全部死亡，给药4 d和7 d后710.06和923.08 mg/kg组存活小鼠体重均显著降低(P<0.01)(图1)。雄性小鼠给药1 d后各剂量组小鼠体重差异不显著(P>0.05)；给药4 d后1 200.00 mg/kg小鼠全部死亡，给药后4 d和7 d后710.06 mg/kg组小鼠体重均显著降低(P<0.01)(图2)。

2.4 病理学检查

试验过程中死亡个体均毛发直立、个体消瘦；剖检可见肝肾肿大，胃内表面有一定程度的充血。试验结束后，小鼠全部处死，实质性器官未发现肉眼可见变化。对照组雌雄个体肝组织结构完整，肝小叶、肝细胞结构清晰，1 200.00 mg/kg剂量组雌雄小鼠与对照组相比，肝组织受损，肝细胞索排列紊乱，肝血窦扩张，内皮细胞脱落，肝细胞核固缩，肝细胞疏松，同时肝细胞肿胀、变性(图3)。

不同的字母代表组间差异显著(P<0.05)

不同的字母代表组间差异显著(P<0.05) Different letters in each cluster mean significant difference (P<0.05)

1A.对照组雌性；2A.1 200.00 mg/kg剂量组雌性；3A.1 200.00 mg/kg剂量组雌性；1B.对照组雄性；2B.1 200.00 mg/kg剂量组雄性；3B. 1 200.00 mg/kg剂量组雄性

对照组雌雄小鼠肾组织结构完整，肾小囊腔明显，肾小球结构清晰，肾小管排列整齐，1 200.00 mg/kg剂量组雌雄小鼠肾组织可见肾小球肿胀充血，肾小囊腔变狭窄,有少量核固缩，肾小管有不同程度扩张、上皮细胞变性、脱落，肾髓袢上皮细胞肿胀空泡化(图4)。

2.5 LD50计算

牛至油的昆明小鼠灌胃LD5为394.04 mg/kg，LD50为688.33 mg/kg，LD95为1 202.4 mg/kg，LD50的95%可信限为584.33 mg/kg～806.34 mg/kg。

3 讨论

试验结果表明昆明小鼠毒性症状随牛至油的剂量增加而逐渐加重，如高剂量组动物全部死亡，2个中剂量组死亡13只，2个低剂量组死亡3只，溶媒对照组小鼠正常。且牛至油的LD50为688.33 mg/kg，其95%可信限为584.33 mg/kg～806.34 mg/kg，根据农业部规定的化学物急性毒性(LD50)剂量分级标准，判定牛至油属于低毒物质。有关牛至油毒性大小的直接研究尚未见报道，仅仅在李学民的博士论文涉及了相关内容。在论文中研究人员给昆明小鼠口服含牛至油的复合纳米乳剂[16]，高剂量组小鼠在给药2 h后,开始出现精神沉郁,反应迟钝,畏寒扎堆,被毛竖立,闭眼俯卧,不食等症状；给药3 h～4 h后出现不同程度的腹泻，随后在48 h内死亡，该研究判定含有牛至油的复合纳米乳剂为低毒物质，与本研究结果一致。

Rc示肾小体，Pt示近端小管，Dt示远端小管。1C.对照组雌性；2C.1 200.00 mg/kg剂量组雌性；3C.1 200.00 mg/kg剂量组雌性；1D.对照组雄性；2D.1 200.00 mg/kg剂量组雄性；3D.1 200.00 mg/kg剂量组雄性

在本试验过程中，高剂量组小鼠给药后当天可见呼吸减弱和腹式呼吸，吸气时腹部明显塌陷，推测与呼吸中枢障碍，肋间肌麻痹和胆碱能神经麻痹有关；同时发现腹部肿胀；还有毛发直立现象，说明毒性涉及自主神经系统；震颤、强制性-阵挛性抽搐、角弓反张等现象同样表明毒性可能涉及自主神经系统、中枢神经系统和神经肌肉。在李学明等的研究中，早期死亡的小鼠死前呼吸困难，抽搐剧烈，死后四肢末端发紫[16]，说明含牛至油的复合纳米乳剂的毒性反应涉及神经系统、呼吸系统和消化系统，支持本试验结果和推断。

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Acute Toxicity Test of Oral Administration of Oregano Oil in KM Mice

OU Rui，NAN Xu-mei，LU Xu-ying，LI Qi，YU Peng

(CollegeofLifeScience，NorthwestNormalUniversity，Lanzhou,Gansu,730070，China)

Oregano oil,as a novel health care medicine for animals,plays an important role in promoting growth,antibiosis,disinfection and enhancing organism immunity.However,its toxicity degree is still unclear.By using the Bliss method in the experiment，the LD50and its 95% confidence of oregano oil in the mice were determined after single oral administration for evaluation of the toxicity within 7 days.The gross anatomy and histopathological examination for the dead mice were also carried out respectively.After single oral administration，the mice showed various degrees of toxic reaction，such as less spontaneous activities，closing eyes，face lying，tremor，bristle， forced paroxysmal spasm，and opisthotonus.The LD50of oregano oil in mice was 688.33 mg/kg and its 95% confidence was 584.33 mg/kg-806.34 mg/kg.All of the dead mice were bristled hair and thin; the liver and kidney damages were obvious,like hepatosplenomegaly.In all,this result indicated that the oregano oil has a certain toxicity after single oral administration in mice,and it was low toxic substance.

oregano oil; acute toxicity; mouse

2016-10-03

西北师范大学青年教师科研能力提升计划项目(NWNU-LKQN-13-8)；国家自然科学基金项目(81660589)

欧 锐(1990-)，女，甘肃白银人，硕士研究生，主要从事细胞生物学。 *通讯作者

S859.8

A

1007-5038(2017)05-0064-05