利用荧光定量PCR技术鉴别畜禽肉中猪源性成分

陆俊贤，唐修君，樊艳凤，贾晓旭，葛庆联，顾荣，王珏，高玉时

（中国农业科学院家禽研究所，农业部家禽品质监督检验测试中心，江苏扬州225125）

利用荧光定量PCR技术鉴别畜禽肉中猪源性成分

陆俊贤，唐修君，樊艳凤，贾晓旭，葛庆联，顾荣，王珏，高玉时*

（中国农业科学院家禽研究所，农业部家禽品质监督检验测试中心，江苏扬州225125）

以猪特异性基因序列为靶位点设计特异性引物，以常见畜禽肉包括猪肉、羊肉、兔肉、牛肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等参考动物肌肉DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，建立猪源性成分荧光定量PCR检测方法；并将猪肉DNA模板浓度进行8个梯度稀释，检测其灵敏度。结果显示，该方法能够有效对猪源性成分进行快速检测，具有较强的特异性，灵敏度较高，可快速准确地鉴别畜禽肉中猪源性成分。

动物源性成分；荧光定量PCR；特异性基因；检测

肉与肉制品掺杂掺假是目前我国食品质量安全面临的重要挑战之一，不法商家为追逐经济利益对动物源性原料以次充好、以假乱真，严重危害消费者的健康和利益。然而，传统的依靠感官与经验的肉类形态学鉴别手段已远不能满足对肉制品掺假现象进行控制与监管的需要。因此，建立快速、准确的检测方法，对食品进行动物源性成分鉴定、对加工肉制品质量进行把关，并有利于肉类产业健康发展。

近年来，荧光定量PCR技术飞速发展为肉类成分检测开辟了新的途径，使得食品中肉类成分的定量分析与溯源成为可能[1-3]。在目标基因选择方面，目前应用较多的是动物线粒体基因组DNA[4-6]。而有关动物特异性基因在畜禽肉动物源性成分鉴别方面的应用鲜见相关报道。

动物特异性基因具有物种的特异性，有望成为肉类成分定性检测的良好靶点[7]。本研究拟根据猪特异性基因的差异性位点，设计筛选特异性引物，建立基于动物特异性基因的荧光定量PCR技术的畜禽肉中猪源性成分快速鉴别方法。

1 材料与方法

1.1 材料

以市售合格的猪、羊、兔、牛、鸽、鹌鹑、鸡、鸭以及鹅肉为试验材料，各物种肉样充分搅碎混匀，－20℃保存备用。

采用试剂盒法离心柱式组织基因组DNA小量抽提试剂盒：北京天根生化科技有限公司；荧光染料预混液SYBR Green mix：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 2500rxn：南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

提取的总DNA样品溶于100 μL Tris－EDTA缓冲液中，于－20℃保存备用。

经测定DNA模板浓度分别为：猪157.67 ng/μL、羊206.52 ng/μL、兔178.7 ng/μL、牛141.46 ng/μL、鸽191.43 ng/μL、鹌鹑125.62 ng/μL、鸡174.57 ng/μL、鸭198.24 ng/μL、鹅115.61 ng/μL。

1.2.2 引物设计与合成

根据猪特异性基因（ENSSSCT00000000833）序列，利用Primer Premier5.0软件设计筛选特异性引物对，交于上海生工生物工程有限公司合成。取适量引物用高压灭菌后的超纯水溶解，配制成10 μmol/L的储备液。引物序列、Tm值与扩增片段大小具体见表1。

1.2.3 反应体系和反应条件

15 μL反应体系：Master Mix（2×）：7.5 μL；Dye：0.3 μL；10 μmol/L上游引物和下游引物：各0.1 μL；DNA模板：1 μL；ddH2O：6 μL。

表1 引物序列、Tm值及PCR产物大小Table 1 Primer sequence，Tm value and the size of PCR product

反应条件：50℃2 min，95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃1 min，40个循环。

1.2.4 特异性实验

分别以猪肉、羊肉、兔肉、牛肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等动物肌肉DNA为模板，对所设计筛选的引物进行特异性实验。

Real－time PCR扩增结束后，通过观察各种动物模板DNA扩增曲线及Ct值来判定其特异性。若无典型扩增曲线且Ct值大于30，判定检测体系无非特异性扩增。反之则认为检测体系与其他物种具有交叉反应。

1.2.5 灵敏度实验

将猪肉DNA模板按梯度进行稀释，分别稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍，观察该方法灵敏度。

2 结果与分析

2.1 猪特异性基因荧光定量PCR特异性检测结果

以9种动物肌肉DNA为模板，进行扩增检测，评价猪检测体系的特异性，反应按照已经优化的条件进行，具体见图1、表2。

图1 猪引物扩增曲线图Fig.1 Amplification curve of pig primer

表2 不同动物DNA模板获得的Ct值Table 2 The Ct value of different animal DNA template

结果显示，所设计筛选的猪引物具有物种特异性。猪引物只有与猪DNA模板反应才会有典型扩增曲线，Ct值为22.78；其余反应均无典型扩增曲线，Ct值大于30或无，且无非特异性扩增。

2.2 灵敏度检测

将猪DNA模板按梯度稀释，从DNA水平确认方法的检测下限，扩增结果见图2、表3。

可见，既有典型扩增曲线，Ct值又小于30的，猪模板稀释倍数达到102倍，即猪模板浓度为1.57ng/μL。

图2 猪引物不同稀释倍数扩增曲线图Fig.2 Different dilution ratio amplification curve of pig primer

表3 不同动物DNA模板不同稀释倍数获得的Ct值Table 3 The Ct value of different dilution ratio of different animals DNA templates

3 讨论

荧光定量PCR技术是利用PCR反应体系中荧光信号的变化对产物生成进行实时监测的技术，应用最广泛的主要包括利用双荧光标记探针的荧光基团解离产生荧光强度变化的TaqMan法，以及利用染料分子插入双链DNA产生荧光变化的SYBRGreen法，本试验主要采用SYBRGreen法。荧光定量PCR技术在食品肉类成分鉴别方面的应用，既提升了定性检测的准确性，又使得定量检测成为可能[8-9]。Dooley等[10]基于线粒体细胞色素b基因，分别建立了牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉和火鸡肉的实时荧光定量PCR检测方法。王颖等[11]以猪线粒体12S rRNA基因序列为靶位点设计引物和探针，进行荧光定量PCR扩增，建立了猪源性成分检测方法。

目前，国内外利用核酸检测为基础的方法体系，对畜禽食品中肉类成分来源进行鉴别与分析的技术已逐渐成熟，尤其是以线粒体编码基因差异为基础进行的食品鉴定方法不断出现[12-14]。Ghovvati等[15]基于线粒体12S rRNA和16S rRNA基因应用多重PCR技术对反刍动物、家禽和猪进行鉴别。何玮玲等[16]基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点，实现了4种肉类（猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉）的快速鉴别。陈冬等[17]基于牛线粒体12S rRNA基因，设计通用引物，成功鉴别混合鲜牛肉及制品中牛种来源。

动物特异性基因是各物种所特有，而基于该基因的畜禽肉中动物源性成分鉴别未见相关报道。本研究主要根据猪特异性基因序列的差异位点设计特异性引物，进行荧光定量PCR扩增检测，观察扩增曲线，对包括猪、羊、兔、牛、鸽、鹌鹑、鸡、鸭、鹅等9种动物在内的畜禽肉进行动物源性鉴别，经过多次重复试验证明，所选定的引物对只有在猪模板DNA存在的情况下才会发生荧光PCR扩增，建立了快速、准确的畜禽肉中猪源性成分荧光PCR鉴别方法。研究结果为打击市场肉制品掺假，保障人民生命安全，维护市场秩序提供了技术支撑。

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[11]王颖,史艳宇,刘金华,等.荧光定量PCR方法检测畜肉食品中猪源性成分[J].食品安全质量检测学报,2013,4(5):1529-1534

[12]Shally Jain,Brahmbhait M,Rank D,et al.Use of cytochrome b gene variability in detecting meat species by multiplex PCR assay[J].Indian J Anim Sci,2007,77(9):880-881

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[15]Ghovvati S,Nassiri M R,Mirhoseini S Z,et al.Fraud identi cation in industrial meat products by multiplex PCR assay[J].Food Control, 2009,20(8):696-699

[16]陈冬,柏凡,周明亮,等.基于线粒体12S rRNA基因鉴别混合牛肉及制品的牛种来源[J].遗传,2008,30(8):1008-1014

[17]何玮玲,张驰,杨静,等.食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法[J].中国农业科学,2012,45(9):1873-1880

The Identification of Pig Origin Ingredients in Livestock and Poultry Meat Based on Fluorogenic Quantitative PCR

LU Jun-xian，TANG Xiu-jun，FAN Yan-feng，JIA Xiao-xu，GE Qing-lian，GU Rong，WANG Jue，GAO Yu-shi*
（Institute of Poultry，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Quality Inspection Center for Poultry Products，Ministry of Agriculture，Yangzhou 225125，Jiangsu，China）

In order to establish a fluorogenic quantitative PCR method，which could identify the components of pig origin，specific genes sequences of pig was used as target sites，and the specific primers were designed.The DNA of common livestock and poultry meat including mutton，pork，rabbit meat，beef，pigeon meat，quail meat，chicken，duck and goose were used as template.And the template was diluted in eight gradients，for detecting the sensitivity.The results showed that the established method could detect the pig origin effectively，which had a quite specificity and high sensitivity.The method could detect the pig origin in livestock and poultry meat quickly and accurately.

animal origin ingredients；fluorogenic quantitative PCR；specific genes；identification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.026

2016-08-24

扬州市社会发展前瞻性研究项目（YZ2014188）；扬州市科技公共服务平台建设（YZ2015162）；2016国家农产品质量安全风险评估项目（GJFP2016007）

陆俊贤（1972—），男（汉），副研究员，硕士，研究方向：家禽品种鉴定与品质评价。

*通信作者：高玉时（1967—），研究员。