响应面法优化厚壳贻贝多糖提取工艺及抗肿瘤活性研究

马铭研，吴惠芳，章璐幸，陈维

（浙江医药高等专科学校，浙江宁波315000）

响应面法优化厚壳贻贝多糖提取工艺及抗肿瘤活性研究

马铭研，吴惠芳，章璐幸*，陈维

（浙江医药高等专科学校，浙江宁波315000）

以厚壳贻贝多糖提取率为响应值，在单因素试验的基础上，以液料比、酶解温度、酶解时间和pH值为试验因素，采用响应面法建立数学模型，筛选最佳提取工艺条件；建立小鼠S180实体瘤模型，分为模型对照组、厚壳贻贝多糖实验低、中、高剂量组、环磷酰胺对照组。测定小鼠肿瘤生长抑制率、脾脏指数和胸腺指数。通过二次回归模型响应面分析，确定厚壳贻贝多糖的最佳提取工艺条件为液料比9.8 mL/g、酶解温度46℃、酶解时间133 min和pH5.9，在此条件下厚壳贻贝多糖提取率为19.2%，与模拟方程得出的18.9%无显著性差异；并且中、高剂量厚壳贻贝多糖对小鼠的肿瘤抑制率分别为36.8%和51.9%。得到酶解法提取厚壳贻贝多糖的最佳提取工艺并证实其免疫增强作用。

厚壳贻贝多糖；响应面；抗肿瘤；酶解法

厚壳贻贝，俗称“淡菜”，在浙江沿海广泛分布，养殖技术成熟。我国古代对贻贝的药用价值就有研究，《本草汇言》载：淡菜，补虚养肾之药也[1]。而在现代研究中，也证实了贻贝提取物含有多种维生素和碘、铁、钙等物质，其中的有维生素B族和多种微量元素具有医治口角炎、舌炎、眼疾和贫血，改善人体血液循环的功能。贻贝还可作为防治动脉粥样硬化和高血压的保健食品[2]。目前，关于厚壳贻贝多糖（Mytilus coruscus polysaccharides，MCP）提取的研究不多，而且没有关于酶解法提取工艺优化的相关研究。通过此试验使用响应面法优化厚壳贻贝多糖提取工艺，并进一步探究厚壳贻贝多糖是否有抑制肿瘤的作用，为厚壳贻贝合理开发应用提供理论基础。

1 材料与仪器

1.1 动物及瘤株

ICR小白鼠，雄性和雌性各25只，清洁级，体质量18 g～22 g：由杭州医学研究中心提供；S－180肉瘤细胞，参考文献[3]方法培养。

1.2 试剂与仪器

正丁醇、乙醇、氯仿、氢氧化钠（均为分析纯）、胰蛋白酶（1 000 U）：宁波奥博有限公司。

可见分光光度计（722S）：上海精密科学仪器有限公司；恒温水浴锅（HH-1，HH-2）：上海精密科学仪器有限公司；电子天平（BS124S）：北京北分天普仪器技术有限公司；离心机（LXJ-IIB）：上海金鹏分析仪器有限公司。

2 方法

2.1 厚壳贻贝多糖的提取

称取100 g厚壳贻贝匀浆，经酶法浸提、脱脂、去蛋白、离心、加乙醇得到厚壳贻贝多糖粗品，冷冻冻干得到厚壳贻贝多糖。

2.2 多糖含量的测定

多糖测定采用苯酚－硫酸法[4]。以葡萄糖（mg/mL）作为标准品制定标准曲线测定提取液中厚壳贻贝多糖的含量，待测样品用纯化水稀释后，使得吸光度值在0.2～0.8的有效范围内。厚壳贻贝多糖提取率计算如下：Y/%=[（A×B）/1 000C]×100，式中：Y为多糖提取率，%；A为由回归方程求得的多糖浓度，（mg/mL）；B为多糖液体积，mL；C为厚壳贻贝质量，g。

2.3 多糖提取单因素试验

分别考察pH值（4.0、5.0、6.0、7.0）、液料比[5、10、15、20（mL/g）]、酶解温度（30、40、50、60℃）和酶解时间（60、120、150、240 min）对厚壳贻贝多糖提取率的影响。

2.4 响应面优化试验

依据单因素试验得到的结果，选择液料比、酶解温度、酶解时间、pH值为变量，根据Box-Behnken设计，进行四因素三水平的响应面分析试验，利用Design Expert软件对数据进行分析，因素水平设计见表1。

表1 响应面因素设计和水平Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

2.5 肿瘤模型的建立

按移植性肿瘤研究法建立小鼠模型[5]。在无菌条件下，于生长状况、体重相同的健康小鼠左后肢皮下接种S180肿瘤细胞液，每只0.2 mL，共50只，雌雄各半，建立荷瘤小鼠模型。

2.6 分组及给药

接种24 h后，随机分成模型组、环磷酰胺组（25 mL/kg）、厚壳贻贝多糖低、中、高剂量组（50、100、200 mL/kg），共5组：每组随机挑选雌、雄小鼠各5只，对每只小鼠分别进行称重，做好标记，并做好记录，每日灌胃给药，连续给药一周。

2.7 体内抗肿瘤作用研究

末次给药24 h后称其体质量，计算体质量增加值；颈椎脱臼处死小白鼠，摘取瘤块、脾脏及胸腺并称重，计算抑瘤率、脾脏指数及胸腺指数。公式如下：

抑瘤率/%=（模型组瘤重-给药组瘤重）/模型组瘤重×100；

脾脏指数=小鼠脾重（mg）/小鼠的体质量（g）；

胸腺指数=小鼠的胸腺重（mg）/小鼠的体质量（g）；

3 结果

3.1 单因素试验

各因素对多糖提取率的影响见图1。

图1 各因素对多糖得率的影响Fig.1 Effect of extraction parameters on yield of MCP

如图1a所示，当提取pH值达到6以上时，多糖提取率达到最大，随着pH值的进一步增加，多糖提取率呈下降趋势，分析原因可能胰蛋白酶在弱酸性环境下分解蛋白的能力变弱，所以选择pH4～6范围提取厚壳贻贝多糖适宜；如图1b所示，当提取温度上升到50℃时，多糖提取率最大，随着温度的升高，多糖提取率没有增加，故选择30℃～50℃为宜；如图1c所示，当酶解时间大于150 min后，多糖提取率有所下降，可能酶解时间过长，酶的活力下降，故选择60 min～150 min为宜；如图1d所示，多糖提取率随着液料比的增加呈先增大后减小的趋势，当液料比为10时，多糖提取率达到最大，然后呈下降趋势，考虑后续工艺处理及生产成本，故选5（mL/g）～20（mL/g）为宜。

3.2 响应面优化试验

利用Design Expert软件设计四因素三水平的响应面分析试验，并对数据进行分析，试验方案见表2。

表2 厚壳贻贝多糖提取率的响应面试验方案和结果Table 2 Box behnken design and the response values for extraction yield of MCP

续表2 厚壳贻贝多糖提取率的响应面试验方案和结果Continue table 2 Box behnken design and the response values for extraction yield of MCP

表2中各试验条件对应的真实值和预测值基本接近，使用Design Expert 8.0.6对表2试验数据进行方差分析结果见表3。

表3 方差分析的拟合二次多项式模型Table 3 The fitted quadratic polynomial model of ANOVA

二次回归方程的拟合得到自变量（X1、X2、X3和X4）与多糖提取率（Y）的二次多元回归方程：

由表3可知，模型的P＜0.05，说明模型极显著，X1、X2、和为显著影响因素，说明对厚壳贻贝多糖提取影响较大，该回归模型的总决定系数和调节决定系数均说明该方程拟合程度好，试验误差小，故该方程模型成立可用于酶解提取多糖的分析和预测。图2为响应值对应各试验因素所形成的响应面剖面图。

图2 各两因素交互影响多糖提取率的响应面剖面图Fig.2 Contour plots showing the interaction between two test variables

由图2可看出各参数之间的相互作用，图中曲线越接近椭圆则反映两因素交互作用越强，曲线越陡峭，表明该因素对多糖提取效率的影响越大[6]。由回归方程经处理得到最佳提取条件为：液料比9.8（mL/g）、酶解温度46℃、酶解时间133 min和pH5.9，在此条件下厚壳贻贝多糖提取率为19.2%，与模拟方程得出的18.9%，吻合良好。

3.3 厚壳贻贝多糖对小鼠S180实体瘤生长的抑制作用

厚壳贻贝多糖对小鼠S180实体瘤生长的抑制作用结果如表4。

表4 厚壳贻贝多糖、CTX对小鼠体重、荷瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响Table 4 Effect of treatment with CTX or MCP in mice bearing S180 tumor on body weight，spleen index and thymus index

厚壳贻贝多糖在低、中、高剂量时对S180肉瘤的抑制率分别为13.7%、36.8%、51.9%，其中中、高剂量时具有显著性意义，P＜0.05和P＜0.01。值得关注的是，环磷酰胺在抑制肿瘤的同时，对小鼠的抑制明显，体质量显著减少，P＜0.01；而从小鼠体质量变化结果得知，厚壳贻贝多糖实验组小鼠体质量均增加，并且高剂量组与模型组相比较有显著差异。

3.4 厚壳贻贝多糖和环磷酰胺分别对荷瘤小鼠免疫器官的影响

如表4环磷酰胺可降低荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，具有明显的免疫抑制不良反应。低剂量的厚壳贻贝多糖对小鼠脾脏指数和胸腺指数没有明显的影响，而中、高剂量的厚壳贻贝多糖可以显著提高荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，P＜0.05和P＜0.01，显示出较强的体内免疫促进作用。说明厚壳贻贝多糖可以改善环磷酰胺对小鼠的免疫损伤。

4 结论

目前，厚壳贻贝多糖的提取主要以热水碱提为主[7]，多糖提取率较低，温度过高也影响了多糖的活性，钟城城等[8]使用联合酶提取粗多糖具有较高的多糖提取率，证明酶解法提取多糖优于传统方法。本研究通过单因素和响应面分析得到酶解提取厚壳贻贝多糖的最佳工艺，液料比9.8（mL/g）、酶解温度46℃、酶解时间133 min和pH5.9，并进行体内抗肿瘤作用研究，中、高剂量厚壳贻贝多糖对小鼠的肿瘤抑制率分别达到36.8%和51.9%，之前的报道主要阐述厚壳贻贝多糖在体外对肿瘤细胞具有抑制作用[9－12]，本研究结果显示，厚壳贻贝多糖在体内也具有一定的抗肿瘤作用，为进一步合理开发利用厚壳贻贝提供理论依据。

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Optimization of Extraction of Mytilus coruscus Polysaccharide by Response Surface Method and Investigation on Antitumor Activity

MA Ming－yan，WU Hui－fang，ZHANG Lu－xing*，CHEN Wei
（Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315000，Zhejiang，China）

Employing a three－level and four－variable Box－Behnken design and setting the Mytilus coruscus polysacchrides（MCP）extraction yield（%）as response value，the optimum enzymatic extraction conditions were as follows：extraction time was 133 min，extraction temperature was 46℃，extraction pH was 5.9，and ratio of liquid to fresh flesh was 9.8 mL/g.Under the optimized conditions，the predict extraction yield indicated from the RSM model was 18.9%，which showed compliance to the experimental yield（19.2%）.The antitumor activity was investigated in mice.The tumor growth inhibitory rate，spleen index and thymus index were calculated.The tumor inhibition rates of medium and high dose MCP were 36.8%and 51.9%，respectively，which were significantly different with model group.Spleen index and thymus index significantly increased in medium and high dose MCP group.It was obviously that MCP could improve the immunity and inhibit the growth of tumor.

Mytilus coruscus polysacchrides；response surface method；antitumor；enzyme extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.007

2016－11－21

国家自然科学基金青年科学基金（21502172）；浙江医药高等专科学校校级课题（201509）

马铭研（1980—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：天然产物开发。

*通信作者：章璐幸（1985—），女（汉），实验师，硕士，研究方向：药物质量与控制。