凡纳滨对虾越冬亲虾黑鳃病症的初步研究

杨求华，杨章武，曹英昆，林 琪，陆 振，何丽斌，周 宸*

(1.福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013；2.河北农业大学海洋学院，河北 秦皇岛 066003；3.汕头大学生物系，广东 汕头 515063)

凡纳滨对虾越冬亲虾黑鳃病症的初步研究

杨求华1，杨章武1，曹英昆2，林 琪1，陆 振3，何丽斌1，周 宸1*

(1.福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013；2.河北农业大学海洋学院，河北 秦皇岛 066003；3.汕头大学生物系，广东 汕头 515063)

为确定越冬凡纳滨对虾亲虾黑鳃病症病因，对患病亲虾病因进行分析。结果显示，越冬后患病亲虾鳃部观察到大量线虫。虫体特征显微结构显示，雌、雄性线虫的平均体长分别为(983.6±16.69)μm和(956.9±12.14)μm，虫体表皮不均质，具有2纵列侧分化、4根头刚毛、3个口腔实齿、5个杯形肛前附器，化感器横向扁椭圆形，食道不形成食道球；经鉴定，确定该线虫隶属于色矛科(Chromadoridae)、色矛属(Chromadorella)。组织病理观察结果表明，线虫感染后亲虾鳃组织坏死、溶解，黑色素沉积，游泳足基部出现黑化层。本文报道了一种由色矛线虫引起的越冬亲虾黑鳃病症。

凡纳滨对虾；黑鳃病症；线虫；病理观察

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，又称南美白对虾，是当前世界养殖产量最高的三大品种之一，具有生长快、抗病力强等特点，自1988年引入我国后[1]，相继攻克了集约化养殖技术和全人工繁育技术，在我国沿海各地实现大规模养殖，产生了良好的经济和社会效益。近年来，随着养殖规模的扩大，疾病也时有发生，包括白斑综合征[2]、桃拉综合征[3]、传染性皮下和造血器官坏死病[4]、细菌性肌肉白浊病[5]、红体病[6]等。

海洋线虫(Nematodes)，属于小型底栖动物的一种，是池塘虾池养殖生态系统中的重要组成部分，广泛分布于虾池环境中[7]，已有研究报道了简单异尖线虫幼虫(Anisakissimplex)、灰海鳗对盲囊线虫幼虫(Contracaecummuraenesoxi)、带鱼针晶蛔线虫幼虫(Raphidascaristrichiur)和对盲囊线虫幼虫(Contracaecumsp.)可感染海水鱼类引发线虫病[8]。2014年4月，福建晋江某凡纳滨对虾亲虾培育基地越冬后亲体虾出现患病症状。本文对患病亲虾进行检查，做病症分析及病理观察，为亲虾疾病的防治提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 患病亲虾

患病凡纳滨对虾取自福建晋江某对虾养殖场室内越冬亲虾，体长为13～15 cm，体重为28～40 g。

1.2 病原分析

1.2.1 样品观察

取典型发病症状的濒死亲虾，剪取发黑部分鳃片于培养皿中，加干净海水并剪取鳃丝做成水浸片，分别在Olympus体视显微镜和Nikon 80i显微镜下观察。

1.2.2 标本的收集与固定

剪取亲虾发黑鳃片及游泳足基部黑斑部分至一干净培育皿中，在解剖镜下用解剖针从鳃丝上逐片寻找虫体，挑出虫体移入另一装有生理盐水的培养皿中。轻轻摇动，将虫体上的污物洗净后用冷巴氏液(甲醛30 mL，NaCl 5.67 g，蒸馏水937 mL，-4℃保存)固定和保存[9]。

1.2.3 线虫鉴定

载玻片和盖玻片用洗涤剂清洗，浸泡在75%的酒精中，制片前取出擦干备用。用石蜡在载玻片上做好直径为1.5 cm的蜡圈，在蜡圈中间滴一滴甘油，挑取大小较为一致的虫体5～10条到甘油里，在解剖镜下将其分散，避免重叠，然后加盖玻片，在50℃加热板上加热到蜡圈融化，待石蜡冷却凝固后即可观察。在Nikon 80i显微镜下进行观察、测量和拍照。根据Platt和Warwick等的描述，将海洋线虫鉴定到分类实体单元或属的水平[10]。

1.3 显微病理分析

取典型发病症状濒死亲虾的鳃及游泳足基部组织，用预冷至4℃左右的Bouin’s[11]固定液固定24 h，切片后H.E染色，在Olympus显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 症状

此次发病的室内越冬亲虾，病症出现于越冬后4—5月。患病虾摄食减少、活力减弱，上浮于水面，游动缓慢，死亡率在10%左右。肉眼观察可见患病虾空胃、游泳足发红，鳃部发黄或有黑色斑点(图1a)；游泳足基部亦可见黑色斑点(图1c)。镜检结果显示，在发病虾鳃丝和游泳足基部黑色组织上有大量细长虫体(图1b)。在放大100倍的单个视野中，虫体数量为10～16只。经初步鉴定该虫体为线虫，隶属于袋形动物门(Aschelminthes)，线虫纲(Nematoda)。

2.2 鉴定结果

显微形态观察结果显示，该线虫雄性平均体长为(956.9±12.14)μm，平均最大体直径为(25.8±0.82)μm；雌性平均体长为(983.6±16.69)μm，平均最大体直径(36.3±1.05)μm；虫体表皮不均质，具有2纵列的侧分化；头刚毛4根，口腔实齿3个，化感器横向呈扁椭圆形、不清晰；食道不形成食道球；具有5个杯形肛前附器；交合器为弯曲的弧形，平均弧长(53.8±1.66)μm、弦长(32.3±1.22)μm，雌性双子宫、阴门所处位置V=0.46，所在体直径平均为(33.2±0.99)μm，肛门所在体直径平均为(24.7±0.86)μm；引带较为明显(图2)。根据相关文献[10，12]对线虫分类特征的表述，确定该线虫隶属于泄腺纲(无尾感器纲，Adenophorea)，色矛亚纲(Chromadoria)，色矛目(Chromadorida)，色矛亚目(Chromadorina)，色矛科(Chromadoridae)，色矛属(Chromadorella)。

注：a：雄性整体；b：雌性整体；c：雌性阴门；d：口器；e：化感器；f：食道；g：肛前附器；h：交合器；i：侧分化。

Notes：a：Male overall；b：Female overall；c：Vulva of female nematodes；d：Mouthparts；e：Amphids；f：Esophagus；g：Precloacal supplements；h：Cross-linking device；i：Lateral differentiation.

2.3 组织病理

组织病理观察结果显示，患病亲虾鳃组织坏死、组织结构崩解，黑色素呈点状沉积(图3a)，游泳足基部组织坏死、黑化层明显(图3b红色箭头)；不过在病理组织切片中未观察到线虫结构，怀疑为线虫体太大且与鳃组织未实质性黏连，在固定及酒精脱色过程中线虫与鳃组织分离，故而线虫未包埋至蜡块。

注：a：鳃组织坏死，黑色素沉积，H.E染色(400×)；b：游泳足基部黑化层，H.E染色(400×)。

Notes：a：Gill tissue necrosis，melanin deposition，H.E staining(400×)；b：Black layer of swim foot base，H.E staining(400×).

3 讨论

对虾“黑鳃病”的由来，最早见于1968年日本石川雄介对日本对虾(Penaeusjaponicus)镰刀菌病的报道。此后的研究中发现引起对虾黑鳃病的病原种类很多，如细菌中的弧菌、丝状细菌、假单胞菌[13-14]；真菌中的镰刀菌、链格孢、链壶菌、地霉、水霉等[15-16]；原生动物中的聚缩虫、拟阿脑虫等[17]；此外病毒和水质不良也有可能引起对虾黑鳃症状。黑鳃病是亲虾越冬期间常见的疾病之一，常造成亲虾死亡，影响亲虾越冬成活率，其中线虫感染是引起越冬期亲虾黑鳃病加重的病因之一[18-19]，此外，在张秋阳、陈朝晖等[13，20]的调查报告中也显示了线虫可感染福建、温州地区斑节对虾(P.monodon)、中国对虾(P.chinensis)、长毛对虾(P.penicillatus)和日本对虾，但这些线虫均未鉴定至种。本文的研究中，笔者将引起越冬凡纳滨对虾亲虾黑鳃病症的线虫鉴定为色矛科、色矛属的色矛线虫。

有报道指出，线虫本为营自由生活，广泛存在于虾池底泥和水环境中[7]，在适宜的条件下才临时生活于对虾鳃、眼窝等部位[13]。关于线虫引起对虾死亡的病因，邓欢等[19]分析为当线虫生活于鳃丝部位后，它从虾体内汲取营养、分泌排泄物，致使虾呼吸能力减弱，窒息死亡；而张勤等[18]指出，即使线虫不直接引起对虾死亡，但其在对虾鳃部的来回穿梭，易造成虾鳃黏液分泌增加，从而引起细菌等继发感染，造成对虾患病死亡。与其他虫体感染相似，当虾体受到线虫感染刺激时，机体将通过一系列反应来制止或减轻虫体对机体造成的损伤，据报道黑色素沉积是对虾对异物刺激所作的积极防御反应[21]。本文组织病理观察结果表明，大量线虫生活于对虾鳃和游泳足基部后，可能造成其他病原的继发感染，从而引起对虾鳃组织和游泳足基部均出现黑色素沉积，这与细菌性引起的黑鳃病症状相似[21]，病变的鳃丝变黑、肥厚，影响虾体正常呼吸，这可能是此次凡纳滨对虾亲虾越冬后出现上浮、死亡的病因所在。

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A preliminary study on overwinter diseased broodstock ofLitopenaeusvannameiwith black-gill

YANG Qiuhua1，YANG Zhangwu1，CAO Yingkun2，LIN Qi1，LU Zhen3，HE Libin1，ZHOU Chen1

(1.Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，Fisheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China；2.Ocean College of Hebei Agricultural University，Qinhuangdao 066003，China；3.Department of Biology，Shantou University，Shantou 515063，China)

To determine the etiology of broodstock ofLitopenaeusvannameiwith black-gill disease，the etiology were analyzed in sick broodstock.The results showed that a large number of nematodes were observed in the gill filament of sick broodstockLitopenaeusvannamei.The characteristics of nematodes micro-structure showed that the length of female and male of nematode were(983.6±16.69)μm and(956.9±12.14)μm，respectively.The features were cuticle heterogeneous with lateral differentiation of two longitudinal rows of dots，buccal cavity with three solid teeth，four cephalic setae，five cup-shaped precloacal supplements，amphids transversely oval and curved，and posterior oesophageal bulb not distinctly set off.According to the morphological analysis，the nematodes were identified as Chromadoridae，Chromadorella.Pathological observation showed that after the nematode parasitization，the gill tissues of broodstock were necrosis，dissolution and melanin deposition，while the swim foot base appears black layer.In conclusion，a black-gill disease in broodstock ofLitopenaeusvannameicaused by nematode of genusChromadorellawas reported in this paper.

Litopenaeusvannamei；black-gill disease symptoms；nematodes；pathological observation

2016-11-04

福建省科技厅公益专项(2015R1003-6)；福建省海洋高新产业发展专项〔闽海洋高新(2014)18号〕；福建省海洋与渔业结构调整专项(2015白虾生态育苗)；闽台重要海洋生物资源高值化开发技术公共服务平台(2014FJPT01)；福建重要海洋经济生物种质库与资源高效开发技术公共服务平台(14PZY017NF17).

杨求华(1988-)，男，硕士，工程师/执业兽医师， 研究方向：水产动植物病害防治. E-mail：qhyang1314@163.com

周 宸(1961-)，男，教授级高工，从事水产病害防治技术研究. E-mail：ccdafj@fjscs.ac.cn

S945.1

A

1006-5601(2017)02-0085-05

杨求华，杨章武，曹英昆，等.凡纳滨对虾越冬亲虾黑鳃病症的初步研究[J].渔业研究，2017，39(2)：85-89.