棒叶蕨藻变种对重金属Cu2＋、Pb2＋和Cd2＋胁迫的生理响应

王荣霞黄 敏陈傅晓谭 围

（1海南省海洋与渔业科学院，海南海口570203；2海南省热带海水养殖技术重点实验室，海南省热带海水养殖工程技术研究中心，海南海口570203；3南海生物资源开发与利用协同创新中心，广东广州510275）

棒叶蕨藻变种对重金属Cu2＋、Pb2＋和Cd2＋胁迫的生理响应

王荣霞1，黄 敏1，2，陈傅晓1，3，谭 围1，3

（1海南省海洋与渔业科学院，海南海口570203；2海南省热带海水养殖技术重点实验室，海南省热带海水养殖工程技术研究中心，海南海口570203；3南海生物资源开发与利用协同创新中心，广东广州510275）

为研究棒叶蕨藻变种（Caulerpa sertularoides f.Longipes）对重金属离子胁迫的生理响应，通过恒温光照培养方法探讨棒叶蕨藻变种在重金属铜离子（Cu2＋）、铅离子（Pb2＋）、镉离子（Cd2＋）的胁迫下对其日特定生长率（SGR）、可溶性蛋白含量、叶绿素a（Chl－a）、谷胱甘肽转移酶（GST）和超氧化物歧化酶（SOD）等指标的影响。结果显示，3种重金属离子的胁迫会影响藻体的正常生长，SGR均出现负增长，可溶性蛋白和Chl－a含量随处理浓度的增大而呈下降趋势，其中Cu2＋的影响尤为明显；重金属对藻体生长的抑制能力大小为Cu2＋＞Pb2＋＞Cd2＋；3种重金属离子对SOD和GST影响均表现为先升后降趋势，除了Cd2＋对SOD影响峰值出现在5.00 mg／L之外，其他处理组的峰值均出现在质量浓度为2.50mg／L时。研究结果可为棒叶蕨藻变种的重金属胁迫机理研究提供参考。

棒叶蕨藻变种；重金属；胁迫；生理响应

海藻与植物一样，体内产生的活性氧与其清除系统保持着动态的平衡，当环境中存在逆境胁迫时，抗氧化系统会增强，从而达到对抗逆境的作用［1］。重金属对水体的污染日渐严重，如果重金属胁迫长期存在，植物细胞会产生大量自由基损伤细胞膜中不饱和脂肪酸和蛋白质，使细胞膜结构松散，严重时会影响细胞膜的结构和功能，对藻体产生巨大伤害甚至死亡［2－4］。国内有关海藻重金属胁迫下抗氧化系统的响应有少量的报道研究，如：钝顶螺旋藻在CdCl2胁迫下，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性随着浓度增加呈现出先上升后下降的规律［5］；龙须菜随着Cd2＋浓度的升高，其生长受到抑制，藻红素、叶绿素a、可溶性蛋白均呈下降趋势［6］。

棒叶蕨藻变种 （Caulerpa sertularoides f.Longipes）属于绿藻门，绿藻纲，蕨藻目，蕨藻科，蕨藻属。对棒叶蕨藻变种的研究主要集中在养殖废水中的氨氮、硝酸盐氮的吸收［7］，以及南美白对虾［8］和番红砗磲［9］生态养殖模式构建等方面，而其对重金属离子胁迫的生理响应等方面的文献报道甚少。本研究着重针对棒叶蕨藻变种对重金属Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋胁迫的生理响应，旨在深入探讨重金属对大型海藻藻体内的生理生化指征的影响，为重金属胁迫机理研究以及大型海藻进行养殖废水处理、改善海区环境研究提供应用参考。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

棒叶蕨藻变种取自海南省三沙市西沙海域的珊瑚礁盘上，先在室外大量扩繁，再在智能人工气候培养箱（赛福PRX－350B）中暂养。培养条件：温度25℃，光照度为8 000～9 000 Lx，盐度31。

1.2 方法

设置3组培养液：Cu2＋（A组）、Pb2＋（B组）、Cd2＋（C组）。每组培养液设计一个空白对照（0.00 mg／L）和 5个浓度梯度，分别为 0.05、0.50、2.50、5.00和10.00 mg／L。空白对照组分别标记为A0、B0和C0，0.05 mg／L实验组标记分别为A1、B1和C1，其他组别以此类推。实验用1 L烧杯装800 mL培养液，在每个烧杯中接种3 g健康藻体，每组金属离子培养液各浓度梯度均设平行3组，培养6 d，每天对培养的棒叶蕨藻变种进行观察，并纪录表征变化情况。在第6天分别测定日特定生长率（SGR）、可溶性蛋白含量、谷胱甘肽－s转移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）活性等指标。

特定生长率（SGR）计算公式：

FSGR＝［（Wt／W0）1／t－1］×100%

式中：W0—初始时刻棒叶蕨藻变种的鲜重，g；Wt—t时刻棒叶蕨藻变种的鲜重，g；t—两次测定间隔时间，d；FSGR—特定生长率，%／d。

叶绿素a测定参照刘涛等［10］方法，可溶性蛋白、谷胱甘肽－s转移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定分别采用南京建成生物公司购买的可溶性蛋白、谷胱甘肽－s转移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒测定。

1.3 数据处理

用Excel软件进行数据处理。SGR等指标在系列浓度重金属下的变化趋势采用线性回归分析（Linear Regression Analysis）方法进行分析。

2 结果

2.1 藻体的表征变化

A0、B0和C0组连续培养6 d，藻体正常。A2组和A3组在培养的第2天藻体棒叶开始出现白化，而A4和A5组在培养的第2天藻体棒叶、假根出现白化和变细。至第6天，A1和A2组棒叶、假根白化、变软；A3、A4和A5组藻体则出现部分白化。在第3天，B3、B4和B5组藻体棒叶、假根开始出现少量白化现象；至第6天，B3、B4和B5组藻体匍匐枝、直立枝、棒叶、假根均出现了白化、脱落，B5组部分藻体出现溃烂，B1和B2组藻体的棒叶、假根开始出现白化和变细；C2、C3、C4和C5组的藻体匍匐枝出现白化、变细，直立枝、棒叶、假根出现白化、脱落。至第6天，C4和C5组的藻体匍匐枝、直立枝、棒叶、假根均出现严重白化、脱落现象；至第6天，C1和C2组藻体的棒叶、假根开始出现白化、变软。

2.2 日特定生长率的变化

图1显示了藻体在培养第6天的FSGR值，其与Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋质量浓度均呈现出负相关性（R2分别为0.917、0.980、0.978），表明藻体的FSGR随着Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋质量浓度增加而下降，出现了负增长，其中Cu2＋的下降速率（k＝－1.775）大于Pb2＋（k＝－1.040）、Cd2＋（k＝－0.942）。由图1可以看出，A1组（FSGR＝－3.13%／d）在培养的第6天对藻体的生长起到非常明显的抑制作用，而B1组（FSGR＝－0.33%／d）和C1组（FSGR＝－0.39%／d）对藻体的抑制作用远小于A1组。

图1 SGR随Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋质量浓度变化情况Fig.1 Changes of SGR according to Cu2＋，Pb2＋and Cd2＋concentrations

2.3 可溶性蛋白含量的变化

藻体的可溶性蛋白与Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋质量浓度均呈现出负相关性（R2分别为0.905，0.943，0.976），表明藻体的可溶性蛋白含量随着Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋质量浓度的增大而呈下降趋势（图2）。

图2 不同Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋质量浓度下可溶性蛋白含量变化Fig.2 Changes of soluble proteins according to different Cu2＋，Pb2＋and Cd2＋concentrations

其中，A组的下降速率（k＝－0.619）高于B组（k＝－0.588）和C组（k＝－0.550）。在实验的第6天，A0、B0和C0组的可溶性蛋白含量分别为3.30、3.06和3.14 mg／g；A1、B1和C1组可溶性蛋白含量仅为A0、B0和C0组的59.1%、91.2%和89.6%；而A5、B5和C5组在实验的第6天分别降至0.11、0.22和0.32 mg／g。

2.4 叶绿素a含量的变化

图3表明，Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋对藻体Chl－a含量的影响与可溶性蛋白的相似，藻体Chl－a的含量随着Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋处理浓度的增大而呈下降趋势，其中A组的下降最为明显，B组次之。实验第6天，A0、B0和C0组的Chl－a含量分别为0.53、0.52和0.56 mg／g，是A3组的6.2倍、B3和C3组的2倍。

图3 不同Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋质量浓度下Chl－a的含量变化Fig.3 Changes of chlorophyll－a according to different Cu2＋2＋，Pb2＋and Cd2＋concentrations

2.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋对藻体SOD活性的影响随着处理浓度的增加呈现出先升后降的趋势。从图4中可以发现，各处理组的SOD值均高于空白对照组（A0、B0和 C0），说明达到0.05 mg／L以上的Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋对藻体均具有胁迫作用。

实验第6天，当A组的浓度≤2.50 mg／L时，SOD与培养液中Cu2＋的浓度呈正相关；在浓度2.50 mg／L时 SOD值达到峰值（195.54 U／mg prot），为 A0组的 4倍；浓度＞2.50 mg／L时，SOD值有所下降。实验第6天，B0组的SOD值为37.89 U／mg prot，SOD随着Pb2＋浓度的增加而呈现先上升后下降的趋势；B3组的SOD值达到峰值（111.24 U／mg prot），为B0组的2.9倍；C组与A和B组不同，其峰值（93.57 U／mg prot）出现在C4组，是C0的2.5倍。

图4 不同Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋质量浓度下SOD的含量变化Fig.4 Changes of SOD concentration according to different Cu2＋，Pb2＋and Cd2＋concentrations

2.6 谷胱甘肽转移酶（GST）活性的影响

Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋对藻体GST活性的影响随着处理浓度的增加呈现出先升后降的趋势。从图5可以发现，所有的浓度处理组的GST值均高于空白对照组（A0、B0和C0），表明大于0.05 mg／L的3种重金属离子对藻体均具有胁迫作用。

图5 不同Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋质量浓度下GST的含量变化Fig.5 Changes of GST concentration according to Cu2＋，Pb2＋and Cd2＋concentrations

实验第6天，A0组GST为15.11U／mg prot，当Cu2＋的浓度≤2.50mg／L时，GST与培养液中Cu2＋的浓度呈正相关，峰值（104.56 U／mg prot）出现在A3组，是A0组的6.9倍；浓度＞2.50 mg／L时，GST值虽有所下降，但仍高于较低浓度组。实验第6天，GST随着Pb2＋浓度的增加而呈现先上升后下降的趋势，B3组的 GST达到峰值（100.76 U／mg prot），为 B0组的 9倍。实验第6天，C0组的GST为10.98U／mg prot，当Cd2＋的浓度≤2.50 mg／L时，GST与Cd2＋的浓度呈正相关性，C3组的 GST达到所有实验组的峰值（158.33 U／mg prot），为C0组的14倍。

3 讨论

3.1 对藻体生长的影响

棒叶蕨藻变种是一种适应能力非常强的藻类，其生长速度较快，具有吸收养殖废水中氨氮和硝酸盐氮的能力［7］。研究表明，重金属能够直接或间接作用于生物体DNA，会引起海洋生物的遗传物质发生突变，引起生长缓慢、异常发展，降低胚胎、幼体及成体的存活率，通过敏感种的灭绝，导致生态退化，对生态系统构成直接和间接的威胁［11－13］。本实验结果显示，Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋的胁迫会影响藻体的正常生长。在培养第6天，藻体均出现不同程度的白化和脱落现象，SGR出现负增长，Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋浓度越大对藻体生长的抑制越大，且Cu2＋的毒性大于Pb2＋和Cd2＋，表明重金属对藻体生长的抑制能力大小依次为Cu2＋＞Pb2＋＞Cd2＋。

3.2 对藻体生化特征的影响

植物在受到重金属污染时，细胞膜的通透性会改变，对叶绿体、线粒体、细胞核等亚显微结构有一定程度的破坏［14］。大型海藻是地球重要的生产者之一，光合色素和捕光色素蛋白种类繁多，其中大多数藻类光能传递的顺序为类胡萝卜素→Chl－b→Chl－a。Chl－a的含量能代表海藻的生产力。重金属的污染会破坏叶绿体膜系统，过量的重金属甚至会破坏叶绿体的结构，重金属的存在一定程度上阻碍了植物对其他营养元素的吸收，阻断了营养元素的运输，影响了叶绿素的正常合成［14］。本实验中，随着Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋浓度的增长，Chl－a含量呈下降趋势，A组下降尤为明显。

可溶性蛋白是植物的渗透调节剂之一，是植物适应环境、增强抗逆性的基础［15］。研究发现，低浓度的Pb2＋对细基江蓠可溶性蛋白的影响不显著，但高浓度（大于5.00 mg／L）的Pb2＋存在显著的影响［16］。本实验中，随着Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋浓度的增长，可溶性蛋白含量越来越低，说明浓度越高，藻体对环境的胁迫响应越明显，其中A组的可溶性蛋白含量下降比B、C组明显。

实验结果表明，藻体对重金属 Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋毒害的生理响应机理是随着重金属离子浓度的增加，Chl－a和可溶性蛋白含量逐渐下降，这可能是由于重金属离子影响了藻体叶绿素的合成，或者直接破坏了叶绿体的结构，加剧影响藻体的光合作用。随着重金属离子浓度和处理时间的增加，重金属离子与－SH基结合导致蛋白变形，也可能是重金属取代了酶蛋白的活性中心，影响了酶的活性，导致蛋白质合成受阻。因此，可溶性蛋白随着实验组浓度的增加而迅速下降，抗氧化系统的平衡随之被打破，相应的抗氧化酶含量也出现变化。

3.3 对藻体抗氧化系统的影响

超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽转移酶（GST）是植物抗氧化系统的两种关键酶。藻体内SOD和GST含量的增加表明了藻体对重金属Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋的胁迫做出了相应的生理响应，增强了藻体对逆境的耐受力。

SOD是一种酸性蛋白，是清除活性氧反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，它能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成O2和H2O，避免由O－2生成破坏力更强大的羟自由基［17］。本实验结果显示，3种重金属离子对SOD影响的变化趋势相似，均为先升后降。A、B组以2.50 mg／L为界限，浓度≤2.50 mg／L时SOD呈现正相关，浓度＞2.50 mg／L时为负相关（C组SOD影响峰值则出现在C4组）。这是因为Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋能激发棒叶蕨藻变种自身的抗逆境体系，诱导SOD活性增加，但这种应激的调节能力是相对有限的，当胁迫强度增强至某一阈值时，SOD活力就出现了下降。实验还发现，SOD对 Cu2＋的响应比 Pb2＋和Cd2＋要灵敏，A3组中Cu2＋的SOD含量分别为B3、C3组的1.75倍和2.5倍，出现这种情况可能与藻体中金属结合蛋白 Cu／Zn－SOD有一定的关系［18］。

GST是动植物重要的解毒酶，其分布广泛且功能多样，主要参与外源性有毒物质的解毒过程［19］。实验中，GST的变化与A、B和C组SOD变化相似，以2.50 mg／L为界，浓度≤2.50 mg／L时GST呈正相关，浓度＞2.50 mg／L的GST呈负相关。这说明在浓度较低时，藻体在较低浓度的Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋外源有毒物质的胁迫下，能增强体内的GST活性来缓解有毒物质的毒害作用。但随着有毒物质浓度的增大，GST的活性也随之降低，说明GST对重金属Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋的耐受力也是相对有限的。GST可以调控谷胱甘肽（GSH）或亲电基团中的巯基、咪唑基和Cd2＋结合并转移，使得细胞质中的Cd2＋保持低浓度［20］。实验中，C3组GST含量约为B3和A3组的1.56倍，可能是GST参与了细胞对重金属Cd2＋的转移过程，使得藻体对Cd2＋有一定的耐受力，这可能也是Cd2＋实验组SOD的峰值出现在C4组的原因之一。

4 结论

Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋三种重金属离子的胁迫会影响藻体的正常生长，SGR均出现负增长，可溶性蛋白和Chl－a含量随处理浓度的增大而呈下降趋势，其中Cu2＋的影响尤为明显。重金属对藻体生长抑制能力大小为Cu2＋＞Pb2＋＞Cd2＋。三种重金属离子对SOD和GST影响的变化趋势相似，均表现为先升后降，除了Cd2＋对SOD影响峰值出现在5.00 mg／L处理浓度之外，其他处理组的峰值均出现在浓度为2.50 mg／L时。其中，Cu2＋的处理浓度为2.50 mg／L时，SOD值达到峰值（195.54 U／mg prot）；Cd2＋的处理浓度为2.50 mg／L时，GST达到峰值（158.33 U／mg prot）。本研究结果可为棒叶蕨藻变种的重金属胁迫机理研究提供参考。 □

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The physical responses of Caulerpa sertularoides f.Longipes to heavy metal（Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋）stress

WANG Rongxia1，HUANG Min1，2，CHEN Fuxiao1，3，TAN Wei1，3
（1 Academy of Marine and Fishery of Hainan Province，Haikou 570203，China；2 Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Seawater Aquaculture Technology，Hainan Provincial Research Center for tropical seawater aquaculture Engineering technology，Haikou 570203，China；3South China Sea Bio－resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center，Guangzhou 510275，China）

In order to study the physiological responses of the algaeCaulerpa sertularoides f.Longipesto heavy metal（Cu2＋，Pb2＋，Cd2＋）stress，constant－temperature illuminating cultivation method has been adopted to explore the influence of the stress from Cu2＋，Pb2＋and Cd2＋on the specific growth rate（SGR），content of soluble protein，chlorophyll－a（Chl－a），glutathione－S－transferase（GST）and superoxide dismutase（SOD）of the algae.The results show that stress of the three kinds of heavy metal ions affects the normal growth of the algae；SGR showed negative growth；soluble protein and Chl－a contents decreased when the content of heavy metal ions increased；the influence of Cu2＋was most obvious.The inhibition ability of heavy metals on the growth of algae was as follows：Cu2＋＞Pb2＋＞Cd2＋.Both the SOD and GST contents，under the influence of the three heavy metal ions，increased first and then declined；the peak effect on the SOD concentration appeared when the concentration of Cd2＋was 5 mg／L，but in other treatment groups the peak effect appeared at the concentration of 2.50 mg／L.This study will provide a scientific basis for the study on the mechanism of heavy metal stress toCaulerpa sertularoides f.Longipes.

Caulerpa sertularoides f.Longipes；Heavy metal；stress；physiological responses

10.3969／j.issn.1007⁃9580.2017.02.005

S955.7

A

1007－9580（2017）02－025－06

2017－01－15

海南省重点研发计划项目（ZDYF2017027）；海南省自然科学基金项目（20164167）

王荣霞（1987—），女，工程师，硕士，研究方向：大型海藻养殖与渔业生态环境。E－mail：103490682＠qq.com

：谭围（1982—），男，高级工程师，硕士，研究方向：水产经济动物繁殖生物学。E－mail：tanwei2599＠163.com