玉米须提取物对皮肤黑素瘤A375细胞迁移的影响及分子机制

吴敬英 黄进梅 李鸣九 古 东



·论著·

玉米须提取物对皮肤黑素瘤A375细胞迁移的影响及分子机制

吴敬英1黄进梅2李鸣九3古 东1

目的： 明确玉米须提取物对皮肤黑素瘤迁移能力的影响。方法： 培养皮肤黑素瘤细胞系A375， 0.3、3、30 μg/mL的玉米须提取物处理A375细胞，划痕法检测A375细胞的迁移能力， 实时PCR检测与迁移相关基因的表达。结果： 玉米须提取物组A375细胞迁移能力低于空白对照组，且浓度越高迁移力越弱；玉米须提取物组上皮间质转化(EMT)相关基因TWIST1、SNAI1、SNAI2、VIM的表达量低于空白对照组， PTGS2基因表达量高于对照组。结论： 玉米须提取物能抑制黑素瘤A375细胞迁移能力，下调EMT相关基因表达。

玉米须提取物； 黑色素瘤； 迁移； EMT

玉米须(corn silk)是指在玉米成熟采集、已经变褐并干枯了的雌花柱[1]。据报道，玉米须提取物对小鼠的肉瘤(S180)、肝癌(Hep)、胃癌(MFC)等肿瘤细胞均有抑制作用，能延长S180荷瘤小鼠的生存时间，增加荷瘤小鼠的免疫器官重量及吞噬功能，保护白细胞，促进T细胞转化增殖[2]。本文研究玉米须提取物对黑素瘤A375细胞迁移能力的影响及分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 玉米须提取物[3]玉米须干粉称重后，用三氯甲烷抽提12 h，然后用沸水煎煮1 h，滤渣再次加水煎煮、过滤；将滤液合并，1∶1浓缩。再加入95%乙醇沉淀12 h，取沉淀物干燥称重、溶解在蒸馏水中，静置后将上清液取出，加入95%乙醇再沉淀12 h。将沉淀物离心、蒸干、称重，计算提取率。

1.1.2 药品及主要试剂 DMEM、标准胎牛血清由Gibico公司提供。皮肤黑素瘤细胞株A375由广州往圣生物科技有限公司购买。RT试剂盒、Real time PCR试剂盒采购自TAKARA公司。Trizol购自Invitrogen公司。引物由上海捷锐生物科技有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米须提取物对A375细胞体外迁移能力影响[4]超净台中常规培养A375细胞(10%胎牛血清、青霉素100 μg/mL、链霉素50 μg/mL、高糖DMEM、37℃、5% CO2)于24孔培养皿，传代12 h后，用200 μL移液枪枪头作划痕，100倍镜下拍照。然后，分别加入配制好的3种浓度的玉米须提取物，使终浓度分别为：30、3、0.3 μg/mL。空白对照组不加药液，继续培养48 h，100倍镜下拍照。实验组每个组别、对照组均设置三个复孔。

1.2.2 玉米须提取物对A375细胞迁移相关基因影响 超净台中常规培养A375细胞于6孔培养皿，然后加入配制好的玉米须提取物，使终浓度为3 μg/mL。空白对照组不加药液。实验组和对照组均设置三个复孔。继续培养48 h，Trizol法提取RNA，进行反转录及real time PCR检测，基因表达量以2-△Ct方法计算[5]，相对表达量的内参基因为beta actin。根据在迁移中扮演的角色，Nguyen等将与迁移相关的基因分为维持肿瘤恶性表型的基因、转移起始基因、转移进展基因和转移毒力基因四类[6]。维持肿瘤恶性表型基因参与了肿瘤的发生和发展，是维持肿瘤细胞恶性表型(无限增殖、基因组不稳定、自我更新、逃避死亡和免疫、乏氧耐受等)和肿瘤细胞转移的必要条件，但这些基因并不直接介导肿瘤的转移[6]。此外，转移毒力基因参与转移克隆的形成和扩增，提高转移肿瘤在新环境中的选择性优势，但这些基因与原发肿瘤的生长和发展关系不大。因此，本研究只检测迁移起始基因、迁移进展基因。其中，迁移起始基因包括：TWIST1、SNAI1、SNAI2、VIM、MTDH，迁移进展基因包括：TGFB1、IL11、PTGS2、STAT3、KLF17。检测引物见表1。

2 结果

2.1 提取结果 玉米须初重为1 kg，提取物为29.8 g，提取率为29.8 g/kg。

2.2 玉米须提取物对A375细胞迁移能力的影响 玉米须提取物能显著抑制A375细胞迁移能力，且呈浓度依赖性，浓度越高，抑制效果越明显(图1)。

表1 检测基因引物

2.3 玉米须提取物对A375细胞迁移能力相关基因的影响 玉米须提取物能下调TWIST1、SNAI1、SNAI2、VIM的表达量，上调PTGS2基因表达量，而对MTDH、TGFB1、IL11、、STAT3、KLF17表达量无显著影响(图2)。

图1 a-d: 0、30、3、0.3 μg/mL玉米须提取物对A375细胞迁移能力的影响

图2 玉米须提取物对A375细胞迁移相关基因的影响

3 讨论

黑素瘤是一种侵袭性强的皮肤恶性肿瘤，近年来逐渐成为常见恶性肿瘤[7]。其进展迅速，极易转移，预后极差，严重危害人类健康。早期黑素瘤主要通过手术切除治疗，但对晚期转移性黑素瘤，目前治疗手段收效甚微。

昌友权等[2]发现玉米须提取物对小鼠的MFC、Hep及S180肿瘤模型均有抑制作用，且此作用可能是通过增加荷瘤小鼠的免疫器官重量及吞噬功能、保护白细胞、促进T细胞转化增殖、提高小鼠的细胞免疫活性而实现，但在体外实验中未检测到玉米须提取物的抑瘤作用。本研究首次发现玉米须提取物对皮肤黑素瘤A375细胞的迁移能力具有显著抑制作用，而且此作用呈浓度依赖性。 本研究未检测玉米须提取物对A375细胞生长能力的作用。

我们进一步研究了玉米须提取物体外抑制黑素瘤A375细胞迁移能力的分子机制。发现玉米须提取物可下调迁移起始基因(TWIST1、SNAI1、SNAI2、VIM)的表达量，而对迁移进展基因(TGFB1、IL11、STAT3、KLF17)无显著影响。事实上，TWIST1、SNAI1、SNAI2、VIM基因是肿瘤上皮间质转化(EMT)的关键转录因子[8]。我们的研究表明，玉米须提取物可抑制皮肤黑素瘤A375细胞的EMT。已经证实，EMT是肿瘤迁移必经阶段。因而，我们认为玉米须提取物可通过抑制EMT而抑制皮肤黑素瘤A375细胞的迁移能力。

玉米须提取物含有多糖、皂苷、挥发油、生物碱、植物甾醇类化合物等具有生物学功能的成分[9-11]。由于时间、条件限制，本研究未对玉米须提取物进一步分离、纯化，找出抑制迁移的主要成分。此外，玉米须提取物下调TWIST1、SNAI1、SNAI2、VIM基因表达量的详细机制亦有待进一步探索。

总之，玉米须提取物抑制皮肤黑素瘤迁移能力，下调EMT相关基因表达，可能是潜在的抗皮肤黑素瘤迁移药物。

[1] 贾淑杰,王蕾,李旭.玉米须提取物的小鼠急性毒性实验及降血糖作用观察[J].天津医药,2012,40(8):809.

[2] 昌友权,王维佳,杨世杰,等.玉米须提取物抗肿瘤作用的实验研究[J].营养学报，2005,(06):498-501.

[3] 柏桦,海春旭,梁欣,等.玉米须提取物清除自由基和抑制脂质过氧化作用[J].癌变.畸变.突变，2008,20(1):36-40.

[4] 吴包金.CXCR4基因沉默对黑色素瘤侵袭和转移影响的实验研究[D].上海:第二军医大学,2009.

[5] 汪阳.miR-199a调控黑色素瘤细胞转移相关基因的筛选[D].长沙:中南大学,2010.

[6] 苏丹,祁鸣.肿瘤转移分子机制研究进展[J].中国肿瘤，2012,(09):686-690.

[7] 耿涛,宋鑫.MicroRNA与黑色素瘤转移相关性研究进展[J].实用肿瘤杂志，2014,(01):18-23.

[8] 杨惠铃,李继功,温宁.上皮间质转化参与口腔鳞状细胞癌侵袭转移机制的研究进展[J].中华老年口腔医学杂志，2015,(06):352-354.

[9] 张百明,赵致臻.玉米须提取物对胆汁淤积性肝病的改善作用研究[J].中国药房，2010,(23):2130-2132.

[10] Lee J, Lee S, Kim SL, et al. Corn silk maysin induces apoptotic cell death in PC-3 prostate cancer cells via mitochondria-dependent pathway[J]. Life Sci,2014,119(1-2):47-55.

[11] Yang J, Li X, Xue Y, et al. Anti-hepatoma activity and mechanism of corn silk polysaccharides in H22 tumor-bearing mice[J]. Int J Biol Macromol,2014,64:276-280.

(收稿：2016-12-19 修回：2016-12-20)

Effects of corn silk extracts on the migration of melanoma cell line A375

WUJingying1,HUANGJinmei2,LIMingjiu3,GUDong1.

1.XinshaHospital,Nansha511473,Guangzhou,China; 2.TheDermatologyInstituteofGuangdong,Guangzhou510090,China; 3.TheChronicDiseasePreventionandTreatmentStation,PanyuDistrict,Guangzhou511400,China

WUJingying,E-mail:gwc19880401@163.com

Objective: To determine the effect and mechanisms of corn silk extracts on the migration of cutaneous melanoma. Methods: The skin melanoma cell line A375 was cultured and was treated by corn silk extracts in the concentration of 0.3, 3,30 μg/mL. The migration of A375 cells was detected by scratch-wound assay and the expression of migration related genes was detected by the Real time PCR. Results: The migration number of A375 cells in the group of corn silk extracts was less than that in the blank group and the higher the concentration, the less migration number was. Compared to the blank group, the expression level of EMT associated genes (TWIST1, SNAI1, SNAI2 and VIM) was lower and the expression level of PTGS2 was higher in the group of corn silk extracts. Conclusion: The corn silk extracts can inhibit the migration of the skin melanoma and increase the expression of EMT related genes.

corn silk extracts; melanoma; migration; EMT

1广州市南沙区新沙医院，广东广州，511473 2广东省皮肤病研究所，广东广州，510090 3广州市番禺区慢性病防治站，广东广州， 511400

吴敬英，E-mail: annawqx@sina.com