不同可拉种质花粉离体萌发研究

李付鹏+谭乐和+郝朝运

摘 要 以2份可拉种质为材料，进行可拉花粉离体萌发研究。结果表明，可拉花粉萌发的最适培养基浓度为20 %蔗糖+200 mg/L H3BO3+300 mg/L Ca（NO3）2。不同种质花粉萌发规律不相同，24 h中Cl-1花粉萌发率随着温度的升高而持续升高，Cl-2花粉萌发率在12：00达到最高继而降至较低水平。本研究结果将为可拉杂交育种，提高稔实率提供理论支撑。

关键词 可拉 ；花粉 ；离体萌发

中图分类号 S571.4

Abstract Studied with 2 copies of Korah germplasm materials of pollen germination on the body. The results showed that the tensile pollen germination of the optimum medium concentration of 20 % sucrose +200 mg/L H3BO3+300 mg/L Ca （NO3）2. The pollen germination rate of different germplasm was not the same. The germination rate of Cl-1 in 24 h increased with the increase of temperature， and the germination rate of Cl-2 pollen reached the highest and then decreased to a lower level in 12：00. The results for Korah cross breeding， improve fertility rate and provide theoretical support.

Key words Korah ； pollen ； germination in vitro

可拉（Cola acuminata schott ex endl）属梧桐科常绿乔木，原产于热带西非常绿低地和山区森林，广泛分布于南北纬15°内的热带地区，主要分布于北纬6°-7°以内的狭窄区域[1]。目前，可拉已种植于非洲、南美、大洋洲、东南亚的20多个国家和地区[2]，海南省及云南西双版纳是中国适宜种植可拉的地区。可拉种子含2 %的咖啡因和脂肪、蛋白质等，具有与茶、咖啡同样的刺激兴奋作用，可用于制酒、饮料、巧克力和药物等[3-4]。据联合国粮农组织（FAO）统计，2012年世界可拉总产量为29.8万t，是西非热带地区重要的经济作物，具有广阔的发展前景。

中国于20世纪60年代开始引种可拉，经过多年观察，在海南兴隆地区能够开花结果[5]。通过试种发现，中国引种的2份可拉种质每年均能正常开花，然而稔实率偏低[6]；将2份可拉种质混合种植，稔实率有所提高，并且种质Cl-1的稔实率明显高于种质Cl-2。花粉萌发和生长是受精以及结实的基础，不同种质、不同环境均会影响花粉萌发以及花粉管生长。本研究以中国热带农业科学院香料饮料研究所收集保存的2份可拉种质为材料，筛选可拉花粉离体萌发最佳的培养体系，分析海南种植可拉稔实率低的原因，也为可拉受精的生理特性研究、种质创新奠定技术基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为中国热带农业科学院香料饮料研究所保存的2份可拉（Cola acuminata）种质Cl-1和Cl-2（图1）。

1.2 方法

1.2.1 花粉采集

于晴天在9：00、12：00、15：00 3个时间点剪取开放的可拉花序，在实验室用镊子夹取雄蕊，用细毛笔将花粉扫落于干净的培养皿中，装于离心管中，避光，备用。

1.2.2 花粉培养方法

花粉采用液体培养法。将湿润的滤纸平铺于直径为20 cm的培养皿中，凹面载玻片置于滤纸之上，并滴上配置好的各种液体培养基50 μL，再将收集的花粉撒播到培养基表面，为了保湿用封口膜将培养皿密封。置于恒温培养箱中，28 ℃黑暗条件下培养3 h。

1.2.3 试验处理

为筛选适宜的立体萌发培养基，利用不同浓度的蔗糖（Sucrose）、硼酸（H3BO3）、硝酸钙（Ca（NO3）2）共组合出18种培养基（表1），每个处理3次重复。经过培养，花粉萌發率最高的培养基即为最适培养基，用于观察比较不同种质花粉萌发。

利用筛选出的15号培养基，分别将在9：00、12：00、15：00 3个时间点收集的Cl-1和Cl-2可拉花粉置于28 ℃黑暗条件下恒温培养3 h，每份种质3次重复。

1.2.4 萌发率检测

使用4.5×10倍Olympus显微镜观察花粉萌发情况，统计视野内的花粉总数、萌发花粉数，花粉萌发以其花粉管长度超过花粉直径为标准，计算花粉萌发率。

萌发率/%=（萌发花粉数/花粉总数）×100

2 结果

2.1 蔗糖对花粉萌发的影响

由表2可见，蔗糖可促进可拉花粉的萌发，并且花粉萌发率随蔗糖浓度的提高而增加。浓度为5 %时，花粉萌发率仅为23.6 %；当浓度提高到20 %时，花粉萌发率显著增加到48.7 %。说明碳源对可拉花粉萌发十分必要，高浓度蔗糖会显著促进可拉花粉的体外萌发。

2.2 H3BO3对花粉萌发的影响

在一定浓度范围内，花粉萌发率随培养基内H3BO3浓度的增加而增加，但超过一定浓度时，H3BO3对花粉萌发具有抑制作用。最适可拉花粉萌发的H3BO3浓度为200 mg/L，在该培养基内花粉萌发率达41.6 %；当H3BO3浓度继续增加到300 mg/L，花粉萌发率下降到36.9 %。

2.3 Ca（NO3）2对花粉萌发的影响

Ca（NO3）2对可拉花粉萌发的影响与H3BO3具有相同趋势，同样是在较低浓度范围内，随着Ca（NO3）2浓度的提高，花粉萌发率增加，超过一定浓度后，花粉萌发率急剧下降。Ca（NO3）2浓度为300 mg/L时，可拉花粉萌发率达到最大值，为41.5 %。

2.4 不同种质花粉萌发与采集时间的关系

由图2可以看出，可拉花粉的萌发率与时间成明显的相关性，并在不同种质间表现出显著的差异。上午9：00种质Cl-1和Cl-2的萌發率均呈现出较低水平，均在15 %以下。随着温度的升高，中午12：00种质Cl-1和Cl-2的花粉萌发率均大幅提升，种质Cl-2的花粉萌发率达60.6 %。12：00之后，种质Cl-1的花粉萌发率继续升高，至下午15：00达80.3 %；种质Cl-2的花粉萌发率转而下降，下午15：00仅有12.4 %。说明在1 d内，可拉花粉的活性与温度密切相关，种质Cl-1的花粉活性随着温度升高而增加，而过高的温度会影响种质Cl-2的花粉活性。

3 讨论

不同植物花粉体外萌发所需的最适培养基组分各有差异[7-9]。多数植物花粉的萌发及生长与蔗糖、硼酸和Ca2+浓度有紧密关联，各组分对花粉萌发及生长的作用有所不同，一定浓度的蔗糖、硼酸以及钙元素对花粉萌发有良好的促进作用。通过试验筛选，可拉花粉萌发的最适培养基浓度为20 %蔗糖+200 mg/L H3BO3+300 mg/L Ca（NO3）2。

可拉花分雄花、雌花和两性花，两性花比例不高，在10 %左右，在开花当天雄蕊虽已发育成熟，而散粉需1-2 d，授粉昆虫为苍蝇[10]，花粉活性会直接影响到稔实率。通过分析开花后1 d可拉花的花粉萌发率，一天中花粉的活性会发生显著变化，并且不同种质间萌发率的变化规律各不相同。一天中，2份可拉种质的花粉萌发率具有一定的互补性，12：00之前Cl-2的花粉萌发率高于Cl-1，12：00之后Cl-1花粉仍有较高的活性。将Cl-1和Cl-2可拉混合种植，花粉可以自由散播，有助于稔实率的提升。种质Cl-2的稔实率低于Cl-1，二者之间差异在于12：00花粉萌发率不同，除花粉活性的因素外，是否与柱头亲和性、花粉管生长等相关有待进一步探讨。

参考文献

[1] Pan A， Jacobs B. The earliest record of the genus Cola （Malvaceae sensu lato： Sterculioideae） from the Late Oligocene （28-27 Ma） of Ethiopia and leaf characteristics within the genus[J]. Plant Systematics and Evolution，2009，283：247-262.

[2] Lim T K. Edible medicinal and non medicinal plants[M]. Cola nitida，2012：175-183.

[3] Beattie G B. Soft drink flavours： their history and characteristics[M]. Cola for kola flavours，The Flavour Industry， 1970：390-394.

[4] Ogutuga D B A. Chemical composition and potential commercial uses of kola nuts Cola nitida（Vent.） schott & endlicher[J]. Ghana Journal of Agricultural Science， 1975， 8：121-125.

[5] 董云萍，龙宇宙，邢谷杨，等. 可拉引种试种研究[J]. 热带农业科学，2000，21（1）：1-8.

[6] 董云萍，杨逢春，吴 刚. 海南兴隆地区可拉果实性状分析[J]. 广东农业科学，2008（12）：28-30.

[7] 王胜华，陈 放，周开达. 水稻花粉的立体萌发[J]. 作物学报，2000，26（5）：609-612.

[8] 戴 丽，孙 鹏，蒋晋豫. 刺槐、红花刺槐、四倍体刺槐花粉体外萌发对比[J]. 东北林业大学学报，2012，40（1）：1-5.

[9] 秦 萌，栗 燕，唐丽丹，等. 紫薇花粉的贮藏方法及离体萌发研究[J]. 河南农业大学学报，46（6）：637-641.

[10] List of crop plants pollinated by bees[DB/OL]. http：//en.wikipedia.org/w/index.php？oldid=446284805.