拟南芥At2g23470基因T-DNA插入突变体的鉴定

李斯琪，宋欣，赵淑清

（山西大学生物技术研究所，山西太原030006）

拟南芥At2g23470基因T-DNA插入突变体的鉴定

李斯琪，宋欣，赵淑清

（山西大学生物技术研究所，山西太原030006）

At2g23470是拟南芥功能未知结构域DUF647蛋白家族的一个成员。为了研究At2g23470基因的功能，需要获得At2g23470功能缺失的突变体材料。根据拟南芥信息资源网站（The Arabidopsis Information Resource，TAIR）上公布的At2g23470基因可利用的T-DNA标签品系，从美国拟南芥生物资源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC）购买了2套独立的At2g23470基因的T-DNA插入GABI-Kat株系种子，运用PCR法对这些T-DNA插入突变体进行了基因型分析和鉴定，结果获得了3个纯合的T-DNA插入位于RUS4启动子上的株系和1个T-DNA插入位于第2外显子的株系。RT-PCR分析表明，T-DNA插入位于第2外显子的株系中，At2g23470基因的表达完全缺失。该突变材料的获得为深入研究At2g23470基因的功能奠定了良好的基础。

拟南芥；GABI-Kat株系；T-DNA

At2g23470是拟南芥功能未知结构域DUF647蛋白家族的一个成员[1]。根据TAIR的最新注释，At2g23470基因参与的生物学过程以及分子功能完全未知（Biological process unknown；Molecular function unknown）。FlowerNet数据显示，At2g23470在花发育后期的花组织和花粉中有中等水平的表达[2]。我们通过人工microRNAs（artificial microRNAs，amiRNAs）技术获得了特异沉默At2g23470基因的突变体[3]。At2g23470-amiRNA突变体由于自花授粉失败而产生短小的角果，但是通过人工授予有活力的花粉可以挽救其不育表型，提示At2g23470是一个与花粉发育相关的基因。

花粉形成和释放通常涉及到基因组中1/2以上的基因表达。高频率的基因突变导致雄性不育，足以说明基因组参与花药和花粉发育的程度。花粉发育和（或）花药开裂的缺陷均可引起雄性不育。近年来，通过对拟南芥雄性不育突变体的研究，已经鉴定了大量参与花粉形成和释放的基因，使人们对花药和花粉发育的机制有了更好的理解[4-10]。然而，目前对控制植物花药发育和花粉发生分子机制的认知仍然不全面，意味着还有许多作用于花药发育过程的基因有待于被发现和鉴定。

根据山西大学植物生殖发育研究组对At2g 23470-amiRNA突变体的研究显示，At2g23470基因可能参与花药和花粉的发育过程。为了深入研究At2g23470基因的功能，需要获得At2g23470基因敲除突变体。本研究从美国俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心购买了分别在At2g23470基因启动子和外显子上有T-DNA插入的2套GABI-Kat插入系，对其基因型进行了分析鉴定，结果获得并证实了4个纯合的T-DNA插入株系，旨在为进一步研究At2g23470基因的生物学功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料拟南芥（Arabidopsis thaliana）T-DNA插入株系（Columbia，Col-0生态型）种子购自美国俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC）；野生型拟南芥（Columbia，Col-0生态型）种子由山西大学生物技术研究所赵淑清课题组保存。

1.1.2 生物学试剂EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司；RNAiso Plus和PrimeScriptTMII RT试剂盒以及TaKaRa Ex Taq购自宝生物工程（大连）有限公司。琼脂糖为BBI生命科学有限公司产品，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。其他生化试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 材料种植拟南芥种子在4℃春化3 d后播种于营养土∶蛭石为3∶1（V/V）的混合土中。培养时先用1/4 Hoagland营养液把土浸透，种植后覆盖塑料膜以保持湿度；当拟南芥种子萌发10 d后去掉塑料膜。培养条件为：温度18～22℃，湿度50%～70%，光暗周期16 h/8 h。

1.2.2 植株基因组DNA的提取采用蔗糖法[11-14]提取拟南芥基因组DNA，略做改动。收集生长14 d左右的拟南芥幼叶样品（直径2～3 mm）于冰置的100 μL的蔗糖溶液（50 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L蔗糖）中，用枪头将叶片压碎。在PCR仪上99℃加热10 min，然后6 000 g瞬时离心。用1 μL上清进行PCR反应。

1.2.3 基因型分析过程和引物的详细信息基因型分析At2g23470基因T-DNA插入突变体是利用T-DNA特异的左边界引物（BP）和跨越插入位点两侧的At2g23470基因座位特异的引物（LP和RP）进行PCR扩增。首先，利用T-DNA边界特异的引物8474和At2g23470基因座位特异引物（RP），通过PCR确认插入特异的产物。然后，利用插入位点两侧的At2g23470基因座位特异的引物（LP和RP）进行PCR确认。在野生型中，LP和RP扩增出At2g23470特异的PCR产物。纯合的T-DNA株系只有BP和RP扩增出插入PCR产物，杂合子则会产生以上2种产物，即插入PCR产物和At2g23470特异的PCR产物（图1）。GABI-Kat系T-DNA的左边界引物BP是8474。对CS433066 T-DNA插入系，At2g23470基因座位特异引物为CS433066-LP，CS433066-RP和BB40；对CS442878插入系，At2g23470基因座位特异引物为CS442878-LP，CS442878-RP和JH21。以样本DNA为模板，分别以8474-BB40和CS433066-LP，CS433066-RP以及8474-JH21和CS442878-LP，CS442878-RP为组合引物进行PCR。引物序列列于表1。

表1 T-DNA插入基因型分析的引物信息

LP和RP是T-DNA植物基因组上T-DNA插入位点两侧目的基因座位特异的引物，8474是GABI-Kat插入系T-DNA区段上左边界引物。经过PCR，野生型用LP和RP扩增出预期大小的目的基因特异的PCR产物；纯合的T-DNA株系只有BP（8474）和RP能扩增出插入PCR产物；杂合子则会产生2种产物。1.2.4PCR扩增和产物检测PCR反应体系：模板DNA 1 μL，正向引物（10 μmol/L）0.25 μL，反向引物（10 μmol/L）0.25 μL，10×EasyTaq buffer 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.8 μL，EasyTaq DNA聚合酶0.2 μL，双蒸水6.5 μL，总体积10 μL，混匀后进行PCR反应。PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，35次循环；最后72℃延伸5 min。PCR产物利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，所用的电泳缓冲溶液为1×TBE，用4SGreen进行染色，电泳电压为5 V/cm。电泳结果用GDS凝胶图像处理系统照相记录。1.2.5RNA提取和RT-PCR分析利用TaKaRa的RNAiso Plus试剂提取拟南芥野生型与待检测T-DNA插入株系叶片的RNA。用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定RNA的浓度。利用Prime-ScriptTMII RT试剂盒对2 μg的RNA合成cDNA。然后，利用At2g23470基因的特异引物At2g23470-F（5′-GGTTTGGCCCATCAGAATCG-3′）和At2g23470-R（5′-GCTCCTTCGCGCAGACAAAT-3′）进行RTPCR检测At2g23470的表达。ACTIN2基因作为内参，ACTIN2引物序列为ACTIN2-F：5′-GGTGATGG TGTGTCTCACACTG-3′；ACTIN2-R：5′-GAGGTTTC CATCTCCTGCTCGTAG-3′。扩增条件：94℃3 min；94℃3 min，58℃30 s，72℃1 min，25个循环；最后72℃延伸5 min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

2 结果与分析

2.1 CS433066 GK-345D06 T-DNA插入突变体的鉴定

为了鉴定拟南芥在At2g23470基因座位上的T-DNA插入突变体，筛选了美国拟南芥生物资源中心（ABRC）2个独立的T-DNA插入系CS433066和CS442878，其分别携带T-DNA插入在启动子和第2个外显子上。

首先，对CS433066插入系一套4个独立的T4株系进行了PCR鉴定，这4个株系的ABRC编号分别为：CS730617，CS730621，CS730622和CS730623。利用引物T-DNA左边界引物8474和At2g23470基因座位特异引物BB40对CS730617，CS730621和CS730623株系的鉴定结果如图2所示。结果显示，CS730617株系10个单株、CS730621株系10个单株和CS730623株系10个单株均得到了清晰的插入特异性扩增条带，产物大约为700 bp。然后，对这3个株系的单株DNA样品利用T-DNA插入两端的CS433066-LP和CS433066-RP引物进行了PCR扩增，其结果如图3所示，野生型样品有预测的1 083 bp大小的At2g23470特异的PCR产物，其余各株系样品均没有扩增条带，说明这些植株在该位点有T-DNA插入。由图2，3可知，CS730617，CS730621和CS730623株系为纯合的T-DNA插入突变体；而CS730622株系样品，利用引物8474和BB40没有扩增条带，但利用CS433066-LP和CS433066-RP引物扩增有At2g23470特异的PCR产物，说明CS730622株系为野生型。在T-DNA插入的T4种子中，单独的株系对于插入有可能是野生型、杂合体和突变体；通过PCR鉴定，获得了3个纯合的CS433066 GK-345D06 T-DNA插入株系，即CS730617，CS730621和CS730623。

2.2 CS442878 GK-447F02 T-DNA插入突变体的鉴定

对T-DNA插入株系CS442878 GK-447F02进行了PCR鉴定，利用T-DNA左边界引物8474和At2g23470基因座位特异引物JH21对ABRC编号为CS305242株系的鉴定结果如图4-A所示，野生型没有扩增条带，CS305242株系18个样品全部有插入条带，产物大小约500 bp；然后，对这个株系的单株DNA样品，利用T-DNA插入两端的At2g23470基因特异的引物CS442878-LP和CS442878-RP进行了PCR扩增，其结果如图4-B所示，野生型样品有预期的大小为1 193 bp的At2g23470特异的PCR产物，其余各单株样品均没有扩增条带，说明这些植株在该位点有T-DNA插入。可以确定CS305242株系为纯合的T-DNA插入突变体。

2.3 RT-PCR分析At2g23470基因在T-DNA突变体中的表达

对筛选到的CS730617，CS730621，CS730623和CS305242 T-DNA插入突变体，采用半定量RT-PCR，利用At2g23470特异的引物进行了基因表达分析，结果显示，在CS730617，CS730621，CS730623等3个株系中，At2g23470基因的表达并没有降低，似乎还有所升高，表明在基因启动子上的T-DNA插入并不一定会引起基因的失活，还有可能引起一定程度的激活（图5-A）。在CS305242 T-DNA插入突变体中，At2g23470基因几乎检测不到，表明T-DNA插入使得CS305242突变体中At2g23470基因完全被敲除（图5-B），这一材料是At2g23470基因的功能缺失突变体。

3 讨论

随着许多物种基因组测序计划的完成，反向遗传学已经成为研究基因功能的一种有效途径[15-17]。反向遗传学是从选择一个已知基因的序列出发，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失和基因干扰等，以期获得该基因突变产生的突变体表型，然后根据突变体表型的变化深入研究该基因的功能。目前，在模式植物拟南芥中已经创造出大量的T-DNA插入突变体，主要有SALK库和GABI-Kat库[18-21]，而且可以很方便地购买到这些突变体种子。但从突变体库中获得种子后，首先需要对突变体进行基因型分析，从而获得纯合的突变体。因为本研究所购买到的T-DNA插入突变体种子只是从T2亲代确认含有T-DNA插入的T3产生的T4独立株系，每一个株系可能是野生型、杂合体或纯合体，必须进行基因型分析鉴定。

本研究通过基于PCR基因型分析基因组DNA的方法，获得了3个纯合的T-DNA插入位于At2g23470启动子上的突变体和1个DNA插入位于At2g23470外显子上的突变体。RT-PCR分析结果表明，突变体中At2g23470基因在第2外显子上的T-DNA插入造成了无效突变，At2g23470在转录水平已完全没有表达，该突变体可以用于At2g23470基因功能的深入研究。然而，在At2g23470启动子上的T-DNA插入，并没有引起At2g23470基因表达的降低，似乎还有所升高，表明在基因启动子上的T-DNA插入并不一定会引起基因的失活，还有可能引起一定程度的激活，这种现象在许多启动子上的T-DNA插入突变体中比较常见。本研究获得的At2g23470敲除的T-DNA突变材料为研究At2g23470基因的功能奠定了基础。

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Identification of Arabidopsis T-DNA Insertion Mutants atAt2g23470Locus

LI Siqi，SONGXin，ZHAOShuqing
（Institute ofBiotechnology，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

At2g23470 is a member of the Domain of Unknown Function 647 protein family that is conserved in diverse eukaryotic organisms.To identify Arabidopsis T-DNA insertion mutants at the At2g23470 locus,we screened the ABRC collections.Two independent T-DNA lines carrying a T-DNA insertion either at the promoter or in the second exon,respectively,were genotyped using PCR-based analysis of genomic DNA.RT-PCR of homozygous T-DNA insertion mutants,using At2g23470-specifc primers,exhibited increased At2g23470 transcript levels in homozygous mutants with insertion at the promoter;whilst At2g23470 transcripts could not be detected in the homozygous mutant with T-DNA insertion at the exon,indicating that it contains a null mutation in the At2g23470 gene. These homozygous mutants have laid a foundation for investigating the function of At2g23470 gene in Arabidopsis growth and development.

Arabidopsis;GABI-Kat lines;T-DNA

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.03

Q943.2

：A

：1002-2481（2017）05-0684-05

2017-02-17

国家自然科学基金项目（31170273）；山西省回国留学人员科研资助项目（2015）

李斯琪（1991-），女，山西夏县人，在读硕士，研究方向：植物分子生物学。赵淑清为通信作者。