水稻脱落酸响应基因分析

樊凌志，季科研，蒲首丞，孙梅好

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

水稻脱落酸响应基因分析

樊凌志，季科研，蒲首丞，孙梅好

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

脱落酸（ABA）参与调节植物的生长和发育，在植物抗击外界环境压力方面起到了重要的作用。为了筛选出水稻体内的脱落酸响应基因，试验设计了OsRD22，OsLTP4，OsLEA7的定量PCR引物，同时利用以终浓度为50 μmol/L的外源脱落酸处理的水稻叶片为材料，分析3种基因对外源脱落酸的响应情况。结果表明，随着外源脱落酸处理时间的延长，OsLTP4，OsLEA7等2种基因的相对转录水平并没有随之增长；OsRD22基因的相对转录水平随着时间的增加，呈现出表达量逐渐升高的趋势。因此，基因OsRD22的表达水平可以作为测定水稻叶片内脱落酸相对含量的指标。

脱酸酸；水稻；相对转录水平；RT-PCR

水稻是世界上最重要的主食作物之一，其提供和保证了热带、亚热带以及亚洲的近30亿人每日的能量摄入。近几年，水稻作为单子叶植物是研究先天免疫的关键模型[1]；而在植物激素方面，特别是激素在水稻防御机制中的作用方面研究却很少。

ABA参与植物生长发育许多方面的调节，包括种子发芽、胚胎成熟、叶衰老、气孔孔径和对外界环境胁迫的适应。因此，ABA在植物防御反应中起重要作用[2]。在不同类型的植物—病原体相互作用中，ABA通常参与植物对各种生物营养和坏死性病原体防御的负调节：ABA主要通过引发胼质体的沉积诱导抗性[3]。HERNANDEZ-BLANCO等[4]提供了ABA信号直接参与控制拟南芥R.solanacearum抗性的证据：在影响次级细胞壁形成所需的纤维素合酶基因的拟南芥突变体中，对响应ABA防御相关基因的诱导明显增加。表明ABA可以通过调节拟南芥中的细胞壁代谢来发挥其对植物的防御作用。同时，在拟南芥中，ABA响应基因包括RD22，LTP4，LEA7基因，相对转录水平都受到外源脱落酸的调节，并且在外源处理拟南芥42 d后，LEA7的相对转录水平是野生型的60倍[5-7]。

本研究以日本晴为材料、拟南芥的内源ABA响应基因[8]为模板，比对水稻的同源基因，通过加入外源ABA处理水稻，探讨水稻体内3种基因（OsRD22，OsLTP4，OsLEA7）表达量，分析脱落酸与这3个基因表达的相关性，筛选水稻内源ABA的响应基因。

1 材料和方法

1.1 材料

试验以日本晴种子为材料。

1.2 方法

1.2.1 培养条件种子经消毒剂（10%的次氯酸钠）处理后，用无菌水漂洗4次，随即放于37℃培养箱进行萌发，3～4 d后取露白种子置于96孔板中，转入光照培养箱中进行水培（28℃/26℃，14/10 h）。三叶期后，用已配制好的新鲜水培培养液（3.3 mmol/L硫酸盐半培养液）培养7 d，转用3.3 mmol/L全培养液继续培养7 d。

1.2.2 水稻脱落酸（ABA）响应基因的对比和引物筛选以拟南芥中脱落酸响应基因AtRD22，AtLTP4，AtLEA7的蛋白质序列为模板，通过BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov）进行比对，获得水稻粳稻OsRD22，OsLTP4，OsLEA7的蛋白质和DNA序列，利用primers 5软件设计3种基因的相应引物，经RT-PCR溶解曲线峰检测引物特异性，从而筛选出特异性引物（表1）。

表1 RT-PCR引物

1.2.3 水稻叶片总RNA提取和cDNA逆转录合成

14 d幼苗经外源脱落酸（50 μmol/L）处理不同时间后，剪取水稻叶片（0.2 g）放置于研钵中，加入液氮，研磨充分至粉末，利用Trizol法[9]提取水稻叶片的总RNA，测量浓度后，将RNA置于65℃的水浴锅中变性5 min，按照表2中列出的试剂逐一加入，水浴37℃15 min，98℃5 min，反应结束后存放于-20℃。

表2 逆转录反应体系（20 μL）

1.2.4 RT-PCR筛选响应基因用设备ABI7500，采用20 μL反应体系，按照表3逐一加入相应的定量试剂（Toyobo）。扩增条件设置为：95℃预变性5 min；95℃变性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸20 s，40个循环。以水稻基因作为内参，并采用2-ΔΔCt法进行定量分析。

表3 RT-PCR反应体系（20 μL）

2 结果与分析

2.1 蛋白质同源性比对

通过对拟南芥中ABA响应基因蛋白质的氨基酸序列进行比对，结果显示，拟南芥ABA响应基因RD22蛋白序列与水稻同源类似物（XM_015772750.1，XM_015775371.1，XM_015763238.1）的氨基酸序列相似度分别为33%，57%和51%。

2.2 OsRD22转录表达分析

经外源脱落酸（终浓度50 μmol/L）处理0，6，12，24 h后，利用定量PCR的方法分析水稻叶片中OsRD22的相对转录水平，结果发现，随着脱落酸处理时间的延长，其相对转录量逐渐增多（图1），处理24 h后其相对转录量是对照的55.7倍。

2.3 OsLEA7转录表达分析

经外源脱落酸（终浓度50 μmol/L）处理0，6，12，24 h后，利用定量PCR的方法分析水稻叶片中OsLEA7的相对转录水平，结果发现，随着脱落酸处理时间的延长，相对转录表达的水平并没有发现任何规律性变化，0～12 h内，随着处理时间的延长，表达量逐渐降低；但是在24 h时，表达量是0 h的12倍（图2）。

2.4 OsLTP4转录表达分析

经外源脱落酸（终浓度50 μmol/L）处理0，6，12，24 h后，利用定量PCR的方法分析水稻叶片中OsLTP4的相对转录水平，结果发现，随着脱落酸处理时间的延长，相对转录表达的水平并没有发现任何规律，0～6 h内，随着处理时间的延长，相对表达量逐渐升高；6～24 h内，随着处理时间的延长，相对表达量先降低后又升高（图3）。

3 讨论

许多非生物胁迫伴随着干燥和渗透压的不平衡，最常见的一种对环境逆境的反应是脱落酸（ABA）水平的短暂上升。ABA的合成会触发多种防御措施，包括气孔闭合和大量应激反应基因的激活，在感染后，植物会产生高度特异性的激素报警信号混合物，导致不同的攻击者特异性免疫应答的激活[10]。近年来，植物生长调节剂被认为在改善植物逆境受损方面具有一定作用，可提高作物的产量和质量[11-12]。ABA参与植物生长和发育许多方面的调节，包括种子发芽、胚胎成熟、叶衰老、气孔孔径和对环境胁迫的适应。最近有研究表明[13]，ABA在植物防御反应中起重要作用。

在拟南芥中，ABA响应基因包括RD22，LTP4， LEA7基因，相对转录水平都受到外源脱落酸的调节，并且在外源处理拟南芥42 d后，LEA7的相对转录水平是野生型的60倍，拟南芥的脱落酸响应基因AtRD22，AtLTP4，AtLEA7蛋白序列与水稻中3种蛋白序列OsRD22，OsLTP4，OsLEA7相似度分别为33%，57%和51%。

为了分析水稻脱落酸的响应基因，本研究选择了OsRD22，OsLTP4，OsLEA7为目标基因，分析了外源脱落酸对3种基因相对表达量的影响，结果发现，经50 μmol/L外源脱落酸处理，可提高水稻叶片中OsRD22的表达，随着外源脱落酸处理时间的增长，OsLTP4，OsLEA7等2种基因的相对转录水平并没有随之增长。利用定量PCR的方法分析水稻叶片中OsRD22的相对转录水平，结果发现，随着脱落酸处理时间的延长，其相对转录量逐渐增多，处理24 h后其相对表达量是对照的55.7倍；0～12 h内，随着处理时间的延长，OsLTEA7的相对表达量逐渐降低，但是在24 h时相对表达量是0 h的12倍；随着脱落酸处理时间的延长，OsLTP4相对转录表达的水平没有发现任何规律。

OsRD22对脱落酸的相对转录表达水平的响应，与拟南芥同源蛋白的表达调控一致。脱落酸在植物的生长发育水平方面发挥着不可或缺的作用，参与调控植物抗生物及非生物胁迫的过程。本研究分析了外源脱落酸对3种基因（OsRD22，OsLTP4，OsLEA7）的响应及敏感程度，结果发现，OsRD22是脱落酸的正相关基因。因此，推测可以利用OsRD22的相对转录水平反映水稻内源脱落酸的相对含量。

［1］SEO Y S，CHERN M，BARTLEY L E，et al.Towards establishment of a rice stress response interactome[J].PLoS Genet，2011，7：e1002020.

［2］MAUCH-MANI B，MAUCH F.The role of abscisic acid in plantpathogen interactions[J].Curr Opin Plant Biol，2005，8：409-414.

［3］FLORS V，TON J，VAN DOORN R，et al.Interplay between JA，SA and ABA signaling during basal and induced resistance against Pseudomonas syringae and Alternaria brassicicola[J].Plant J，2008，54：81-92.

［4］HERNANDEZ-BLANCO C，FENG D X，HU J，et al.Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.[J].Plant Cell，2007，19：890-903.

［5］IWASAKI T，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，SHINOZAKI K.I-dentification of a cis-regulatory region of a gene in Arabidopsisthaliana whose induction by dehydration is mediated by abscisic acid and requires protein synthesis[J].Molecular Genetics and Genomics，1995，247（4）：391.

［6］ARONDEL V，VERGNOLLE C，CANTREL C，et al.Lipid transfer proteins are encoded by a small multigene family in Arabidopsis thaliana[J].Plant Science，2000，157（1）：1-12.

［7］LINSTER E，STEPHANI，BIENVENUTWV，et al.Downregulation of N-terminal acetylation triggers ABA-mediated drought responses in Arabidopsis[J].Nature Communications，2015，6：7640.

［8］YOSHIDAR，HOBO T，ICHIMURA K，et al.ABA-activated SnRK2 protein kinase is required for dehydration stress signaling in Arabidopsis[J].Plant and Cell Physiology，2002，43（12）：1473-1483.

［9］YAMADA S，KANO A，TAMAOKI D，et al.Involvement of OsJAZ8 in jasmonate-induced resistance to bacterial blight in rice[J].Plant Cell Physiol，2012，53（12）：2060-2072.

［10］DE VOS M，VAN OOSTEN V R，VAN POECKE RMP.Signal signature and transcriptome changes of Arabidopsis during pathogen and insect attack[J].Mol Plant-Microbe Interact，2005，18：923-937.

［11］SEO H S，KIM S K，JANG S W，et al.Effect of jasmonic acid on endogenous gibberellins and abscisic acid in rice under NaCl stress [J].Biologia Plantarum，2005，49（3）：447-450.

［12］MAHMOOD M，BIDABADI S S，GHOBADI C，et al.Effect of methyl jasmonate treatments on alleviation of polyethylene glycol-mediated water stress in banana（Musa acuminata cv.′Berangan′，AAA）shoot tip cultures[J].Plant Growth Regul，2012，68：161-169.

Analysis of Abscisic Acid Response Gene in Rice

FANLingzhi，JI Keyan，PUShoucheng，SUNMeihao
（College ofChemistry＆Life Science，ZhejiangNormal University，Jinhua 321004，China）

Abscisic acid is the regulator in the plant growth and development,which plays vital roles in plant developments and dealing with biotic and abiotic stresses.To analyze rice marker genes for abscisic acid,three genes（OsRD22，OsLTP4，OsLEA7）were selected,and their relative transcription levels were studies by quantitative PCR（qPCR）using rice leaves treated with abscisic acid（50 μmol/L）.Results of qPCR demonstrated that transcription of OsLTP4 and OsLEA7 were not upregulated by abscisic acid.On the contrary,the transcription of OsRD22 was upregulated by abscisic acid.So as the result,we proposed that the relative transcription levels ofOsRD22 could be used toindicate relative levels ofactive abscisic acid in rice leaves.

abscisic acid;rice;relative transcription levels;RT-PCR

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.04

S511

：A

：1002-2481（2017）05-0689-04

2017-01-20

国家自然科学基金项目（31070055）；浙江省本科院校中青年学科带头人学术攀登项目（pd2013060）

樊凌志（1991-），女，山西晋中人，在读硕士，研究方向：蛋白质结构与功能。孙梅好为通信作者。