血清miRNA-21与肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1、NSE对早期非小细胞肺癌的诊断价值

季禹乔，孙明忠*，朱 晖，唐庆国，王文才，王 进，张灵芝，吴芹芹

(东南大学医学院附属盐城医院 1.检验科，2.心胸外科，江苏 盐城224001)

血清miRNA-21与肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1、NSE对早期非小细胞肺癌的诊断价值

季禹乔1，孙明忠1*，朱 晖1，唐庆国1，王文才2，王 进2，张灵芝1，吴芹芹1

(东南大学医学院附属盐城医院 1.检验科，2.心胸外科，江苏 盐城224001)

目的 探讨miRNA-21与CEA、CYFRA21-1、NSE对早期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的诊断价值。方法 以50例NSCLC患者作为病例组、60例健康人为对照组，检测所有研究对象的血清癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及miRNA-21(miR-21)水平。结果 病例组血清CEA、NSE、CYFRA21-1、miR-21水平均显著高于对照组(P<0.01)。CEA、NSE、CYFRA21-1、miR-21诊断NSCLC患者的受试者特征工作曲线(ROC曲线)下面积(AUC)分别为0.918、0.826、0.853、0.866，以CEA诊断效能最高。TNMⅠ-Ⅱ期的NSCLC患者血清miR-21水平、血清CYFRA21-1水平均低于TNM Ⅲ-Ⅳ期的患者(P<0.05)。Logistic多元回归分析结果显示，早期NSCLC(TNMⅠ-Ⅱ期)的发生与血清CYFRA21-1水平、血清miR-21水平均具有相关性(P<0.05)。CEA、NSE、CYFRA21-1、miR-21诊断早期NSCLC的AUC分别为0.752、0.806、0.843、0.882，miR-21诊断早期NSCLC的效能最高。单独应用血清CYFRA21-1水平检测、单独应用血清miR-21水平检测和联合应用两种血清标志物检测的AUC分别为0.843、0.872和0.909。结论 NSCLC患者血清miRNA-21与CEA、CYFRA21-1、NSE表达异常，血清miR-21水平对于早期NSCLC的诊断效能较高，可作为辅助诊断的重要血清标志物，将其与血清CYFRA21-1水平进行联合检测，可提高其诊断效能。

微小RNA-21；肿瘤标志物；癌胚抗原；细胞角蛋白片段21-1；神经元特异性烯醇化酶；非小细胞肺癌；诊断

(ChinJLabDiagn,2017,21:0576)

在基因表达和进化过程中，高度保守、性质稳定的微小RNA(miRNA)在调节致癌基因表达方面发挥着重要的作用，与细胞增殖、分化以及恶性肿瘤发生、发展、侵袭、转移等密切相关。研究表明，miRNA参与了肺癌的发生、发展和预后，具有与原癌基因或肿瘤抑制基因相似的作用，在肺癌组织中miRNA有特定的表达谱，参与了调节肿瘤血管生成等多个过程[1，2]。因此，miRNAs可作为生物学标志物用于NSCLC的早期诊断、靶向治疗及临床预后评价。本研究针对血清miRNA-21 (miR-21)及CEA、NSE、CYFRA21-1等血清标志物检测在早期NSCLC诊断中的价值进行了对比分析，结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2015年1月我院收治的NSCLC患者50例作为病例组，纳入患者均经行肺癌肿瘤切除术，术后组织病理学检查证实为NSCLC，术前均未接受过放、化疗治疗。其中，男38例、女12例，年龄为45-81岁，平均年龄为(60.8+8.7)岁，鳞癌29例、腺癌21例，TNM分期为：Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期19例，Ⅳ期9例。同期选取60例体检合格者为对照组，其中，男47人、女13人，年龄为42-78岁，平均(62.6+8.8)岁。两组研究对象在年龄、性别构成等方面的差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究纳入的所有研究对象均对研究方案知情并签署知情同意书，研究方案经我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 观察指标

采集研究对象的空腹外周静脉血标本(病例组于入院次日，对照组于体检当日)，血液样本经常规离心后分离血清，应用全自动电化学发光免疫分析仪(罗氏公司生产)采用双抗体夹心磁微粒化学发光法对血清标本中的CEA、NSE及CYFRA21-1水平进行检测和比较，试剂盒为仪器配套试剂盒，严格按产品说明步骤进行操作；应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法对血清标本中的miR-21表达水平进行检测和比较，具体步骤为应用RNA提取试剂盒(美国ABI公司生产)于采集血样7天内提取总RNA，提取后立即置于-80℃冰箱内保存，采用反转录试剂盒(美国ABI公司生产)对miRNA进行反转录，反转录体系为15 μL，包括100 mmol/L dNTPs 0.15 μl、MultiScribe Reverse Tran scriptase 1 μl、10×Reverse Transcription Buffer 1.5 μl、RNase Inhibitor 0.19 μl、无菌注射用水4.16 μl、以无菌注射用水1∶1稀释后的总RNA 5 μl、RT primer 3 μl，引物序列通过查询Sanger microRNA序列数据库获得，为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，反转录条件为16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃5 min，4 ℃恒温，获得的反转录产物立即应用RT-PCR系统(美国ABI公司生产)进行定量检测，PCR反应体系为20 μl，包括Taq Man Universal Master MixⅡ 10 μl，无菌注射用水4 μl，Taqman MicroRNA Assay 1 μl，以无菌注射用水1∶1稀释后的反转录产物5 μl。PCR检测反应条件为：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 个循环。通过PCR自带软件生成基线和阈值后，以miR-16为内参，直接读取各样本中的miR-21、miR-16的循环阈值(Ct值)，即扩增产物量达到临界阈值时所对应的循环数，△Ct为miR-21的Ct 值与miR-16的Ct 值的差值，以2-△△Ct表示miR-21的表达水平。

1.3 统计学分析

本研究所有数据均应用SPSS 13.0统计软件包建立数据库，计量资料采用(均数±标准差)的形式表示，两组之间比较应用独立样本t检验进行处理，以P<0.05为差异有统计学意义，计数资料采用百分率的形式表示。血清标志物诊断效能的比较应用受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)进行比较，取Youden指数最大时的数值作为最佳筛查阳性界值(cut-off)值，并据此对血清标志物单独检测和联合检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、误诊率、漏诊率、约登指数进行计算和比较。

2 结果

2.1 两组研究对象血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平的比较

病例组患者的血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平均显著高于对照组，两组之间的差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。不同性别、年龄、病理类型的NSCLC患者的血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平的差异及不同临床分期的NSCLC患者的血清CEA、NSE水平的差异均无统计学意义(P>0.05)，TNM分期为Ⅰ-Ⅱ期的NSCLC患者的血清miR-21水平、血清CYFRA21-1水平均低于TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期的患者，两者之间的差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 两组研究对象血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平的比较

表2 NSCLC患者临床特征与血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平的相关性

2.2 血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平检测针对NSCLC的诊断效能比较

四种血清标志物诊断NSCLC的AUC分别为0.918、0.826、0.853、0.866，CEA诊断NSCLC的效能最高，见图1A、表3。

表3 血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1检测对NSCLC的诊断效能比较

剔除晚期肺癌(TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期)病例数据后，CEA、NSE、CYFRA21-1 、miR-21诊断早期NSCLC(TNM分期为Ⅰ-Ⅱ期)的AUC分别为0.752、0.806、0.843、0.882，miR-21诊断早期NSCLC的效能最高，见图1B、表4；应用Logistic多元回归分析对四种血清标志物水平与早期NSCLC的相关性进行分析，结果显示，早期NSCLC的发生与血清CYFRA21-1水平(OR=1.076)和血清miR-21水平(OR=2.473)具有相关性(Waldχ2=4.025、9.153，P<0.05)，见表5；将应用血清CYFRA21-1水平与血清miR-21水平联合检测与单独应用其中之一进行检测进行比较，结果显示，单独应用血清CYFRA21-1水平检测、单独应用血清miR-21水平检测和联合应用两种标志物检测的AUC分别为0.843、0.872和0.909，见图1C、表6。

A) 诊断NSCLC；B)早期NSCLC(TNM分期为Ⅰ-Ⅱ期)；C) 血清miR-21、CYFRA21-1水平单独及联合检测诊断早期NSCLC

检测变量AUC标准误显著性95%可信区间下限上限CEA0.9180.0340.0000.8510.985NSE0.8260.0410.0000.7470.906CYFRA21-10.8530.0370.0000.7800.925miRNA-210.8660.0360.0000.7960.936

表4 血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平检测针对早期NSCLC的诊断效能比较

表5 血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平与早期NSCLC相关性的多因素分析

表6 血清miR-21、CYFRA21-1水平单独及联合检测对于早期NSCLC的诊断效能比较

3 讨论

肺癌是全球发病率和死亡率最高的肿瘤，在肺癌病例中，约80%为非小细胞肺癌(NSCLC)病例。近年来，NSCLC发病率出现了逐年增高的趋势，无论是在我国还是全世界范围，NSCLC均已成为致死率最高的肿瘤[3-5]。在吉非替尼、厄洛替尼、克唑替尼等新型分子靶向药物相继进入临床应用后，含铂两药联合方案及靶向治疗方案有一定程度上提高了晚期NSCLC的疗效[6-8]。尽管如此，晚期NSCLC患者的生存率并未得到显著的提升，总体预后仍然较差[3-5]，因此，提高早期NSCLC的诊断率仍然是改善NSCLC患者预后的关键手段。经支气管镜，纵隔镜或胸腔穿刺进行组织活检是诊断NSCLC的最可靠方法，但这些有创性检查在应用时具有较多的禁忌症，不能作为早期筛查和连续监测的手段。血清学标志物检测具有操作简便、价格低廉、无创伤、样本易获得、可连续监测等诸多优点，一直是早期NSCLC辅助诊断手段研究领域的热点。目前，临床上已经先后探讨癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、糖蛋白-199(CA-199)、细胞角蛋白5/6 (CK5/6)、细胞角蛋白HMW(CK-HMW)、甲状腺转录因子-1(TTF-1)和细胞角蛋白8/18(CK8/18)等诊断价值，但尚未寻找到一种可以单独用于早期NSCLC诊断的可靠指标[9]，联合检测已成为提高血清标志物针对早期NSCLC诊断效率的主要手段。

本次研究结果显示，病例组血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平均显著高于对照组(P<0.01)，这说明NSCLC患者血清miR-21及常规血清标志物的异常表达。血清CEA、NSE、CYFRA21-1和miR-21诊断NSCLC的AUC分别为0.918、0.826、0.853、0.866，提示CEA是NSCLC发生的最有效指标。CEA是一种广谱性肿瘤标志物，可在多种肿瘤中表达，而且还与肿瘤恶性化具有密切的相关性，在临床上主要用于辅助诊断恶性肿瘤、判断肿瘤分期和病变程度、监测治疗和预报复发等方面。研究表明，NSCLC患者血清CEA水平与其EGFR基因突变率具有相关性，血清CEA水平可作为指导NSCLC靶向治疗的指标[10]。血清CEA水平也是影响NSCLC患者预后的独立因素，NSCLC患者CEA水平的升高与其术后生存率的下降相关，血清CEA水平的高低可用于预测手术切除肿瘤后的NSCLC患者的预后，对于难以获得组织标本的复发晚期NSCLC患者，其水平也可作为预测EGFR-TKI药物疗效的参考指标[11]。尽管如此，本研究未观察到不同TNM分期患者血清CEA水平差异表达，这说明CEA对早期NSCLC的指示作用并不显著。

本次研究结果显示，TNM分期为Ⅰ-Ⅱ期的NSCLC患者的血清miR-21水平、血清CYFRA21-1水平均低于TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期的患者(P<0.05)，Logistic多元回归分析结果显示，早期NSCLC(TNM分期为Ⅰ-Ⅱ期)的发生与血清CYFRA21-1水平和血清miR-21水平具有相关性(P<0.05)。血清CEA、NSE、CYFRA21-1和miR-21诊断早期NSCLC的AUC分别为0.752、0.806、0.843、0.882，miR-21诊断早期NSCLC的效能最高，单独应用血清CYFRA21-1水平检测、单独应用血清miR-21水平检测和联合应用两种血清标志物检测的AUC分别为0.843、0.872和0.909，这说明在本研究选取的四种血清标志物中，miR-21、CYFRA21-1的表达水平与患者的TNM分期具有一定的相关性，对于早期NSCLC的诊断具有一定的辅助作用，在单独检测时，血清miR-21水平诊断早期NSCLC的效能要高于其它标志物，可作为辅助诊断早期NSCLC的重要血清标志物，而将血清miR-21水平和血清CYFRA21-1水平进行联合检测可提高其诊断效能。既往研究证实，肺癌组织中miR-21的表达水平显著高于正常肺组织，肿瘤组织miR-21高表达的肺癌患者的复发转移率显著高于miR-21低表达的患者，且患者生存期也会明显降低[12]。根据一项针对8篇研究文献、600例病例，440例对照研究对象的Meta分析结果[13]，血清miR-21诊断早期肺癌的合并敏感度为72%，合并特异度为84%，AUC为0.898。与该研究相比较，本研究结果在敏感度估算方面存在一定的差异，这种差异可能与本研究样本量少于Meta分析研究有关，也可能与该研究选取的研究对象包含其它类型肺癌病例有关。

CYFRA21-1是一种上皮来源的新型肿瘤标记物，血清CYFRA21-1水平与肺癌患者的影像学疾病控制(DC)和无进展生存期(PFS)等指标具有相关性[14]，可敏感地反映影像学肿瘤体积大小的变化，可作为评价进展期NSCLC患者化疗疗效的替代指标[15]。本研究中未得出NSE在诊断NSCLC特别是早期NSCLC方面具有优势的结果。作为肿瘤标志物，NSE主要是与神经母细胞瘤和小细胞肺癌(SCLC)特异性相关，而在NSCLC诊断方面的作用则不及其它一些肿瘤标志物[16]，在临床上经常将NSE与CEA、CYFRA21-1、CA199、糖蛋白抗原125(CA125)、鳞状细胞癌相关抗原(SCC)等进行联合检测，用于各类肺癌患者的鉴别诊断、化疗疗效评价和预后评价[16]。

综上所述，NSCLC患者表现为血清miR-21及血清肿瘤标志物的异常表达，血清miR-21水平对于早期NSCLC的诊断效能较高，可作为辅助诊断的重要血清标志物，将其与血清CYFRA21-1水平进行联合检测，可提高其诊断效能。

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Serum miRNA-21 and CEA,CYFRA21-1,NSE in Diagnosis of Early Non-Small Cell Lung Cancer

JIYu-qiao,SUNMing-zhong,ZHUHui,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,TheAffiliatedYanchengHospitalofSoutheastUniversityMedicalCollege,Yancheng224001,China)

Objective To compare serum miRNA-21 and serum tumor markers detection in diagnosis of early non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods Fifty patients with NSCLC were treated as the case group and 60 cases of healthy people were treated as the control group.The serum carcinoma embryonic antigen (CEA) and cytokeratin protein fragment 21-1 (CYFRA21-1),neuron specific enolase (NSE) and miRNA (miR-21) levels were detected and analyzed in all subjects.Results The serum miR-21,CEA,NSE,CYFRA21-1 levels in the case group were significantly higher than those in the control group (P<0.01).The areas under receiver operating characteristic curve (ROC curve) of serum CEA,NSE,CYFRA21-1 and miR-21 were 0.918,0.826,0.853 and 0.866 in diagnosis of NSCLC.The efficiency of CEA in diagnosis of NSCLC was the highest.The serum miR-21 and CYFRA21-1 level of the NSCLC patients with TNM stage of Ⅰ-Ⅱ stage were lower than those of Ⅲ-Ⅳ stage (P<0.05).Logistic multivariate regression analysis showed that the incidence of early NSCLC (TNM stage of Ⅰ-Ⅱ stage) was correlated with the serum CYFRA21-1 level and the serum miR-21 level (P<0.05).AUC of serum CEA,NSE,CYFRA21-1 and miR-21 were 0.752,0.806,0.843,0.882 in diagnosis of early NSCLC.The efficiency of miR-21 was the highest in diagnosis of early NSCLC.The AUC were 0.843,0.872 and 0.909 for detection of serum CYFRA21-1 only,miR-21 only and the combination detection.Conclusion The miRNA-21 and CEA,CYFRA21-1,NSE are abnormal expression in patients with NSCLC.The efficiency of serum miR-21 detection is higher in diagnosis of early NSCLC and can serve as a serum marker.The combination detection of serum miR-21 and CYFRA21-1 can improve efficiency.

miroRNA-21;tumor markers;carcinoma embryonic antigen;cytokeratin protein fragment 21-1;neuron specific enolase;non-small cell lung cancer;diagnosis

江苏省盐城市科技发展计划项目(YK2013073)

1007-4287(2017)04-0576-06

R734.2

A

2016-09-16)

*通讯作者