皱纹盘鲍与西氏鲍杂交受精过程荧光显微观察

王海山,吕文刚，叶 乐，李卫东，柯才焕

(1.海南热带海洋学院 生命科学与生态学院，海南 三亚572022；2.厦门大学 海洋与地球学院，福建 厦门 361005)

皱纹盘鲍与西氏鲍杂交受精过程荧光显微观察

王海山1,2,吕文刚1，叶 乐1，李卫东1，柯才焕2

(1.海南热带海洋学院 生命科学与生态学院，海南 三亚572022；2.厦门大学 海洋与地球学院，福建 厦门 361005)

本研究采用荧光显微技术对皱纹盘鲍(Halilotisdiscushannai)♀×西氏鲍(H.gigantea)♂的受精过程及受精卵的早期发育进行了观察,并采用FITC-anti-α-tubulin对精子入卵位置进行标记.结果显示西氏鲍的精子可正常激活皱纹盘鲍的卵子,精子进入卵子2-5 min后受精卵开始第一次卵裂,释放出第一极体.随着受精卵的发育卵子完成第二次减数分裂,排出第二极体,同时形成早期精卵原核.精卵原核膨胀并彼此融合,受精卵开始进行有丝分裂完成第一次卵裂.通过FITC标记的anti-α-tubulin蛋白免疫荧光观察,发现精子在入卵时会在卵膜表面,形成一个类似于受精孔的结构.

杂交鲍;受精;荧光显微观察

0 引 言

鲍类作为我国传统的名贵食材,被誉为四大海味之首.中国的鲍养殖产量约占世界养殖产量的85%左右,长期占据世界第一的位置.2012年我国养殖鲍产量达到90694吨,实现连续十年的快速增长.其中福建省养殖鲍产量达65247吨,占全国总量72%.丰厚的利益驱使下使得鲍类养殖产业规模迅速扩大,但随之带来了一系列问题：为了追求低成本高回报的目的,养殖户对鲍的种质资源缺乏保护意识,长期的近亲繁育和累代养殖造成了种质明显退化,大规模疾病时有发生,鉴于以上原因鲍类优良品种选育的研究逐渐增多.聂宗庆等进行了皱纹盘鲍、红鲍和绿鲍的交杂实验，初期的研究发现皱纹盘鲍♀×红鲍♂相对于其他杂交组合具有较快的生长速度并且更适应低温环境[1].王仁波等对红鲍与皱纹盘鲍进行了杂交实验,指出正反交子代在不同的养殖条件下都比父母本具有较高的生长速度[2].燕敬平等以盘鲍和皱纹盘鲍作为亲本培育出杂交鲍苗,与皱纹盘鲍自繁鲍苗相比杂交鲍苗在壳长生长和存活率方面均表现出较强的杂种优势[3].孙振兴等报道了皱纹盘鲍与盘鲍的正交组合杂交子代养殖四个月后的湿重(36.9%)和干重(29.2%)均显著高于盘鲍自繁子代[4].柯才焕等对杂色鲍、皱纹盘鲍、盘鲍三种鲍之间的种间杂交组合进行研究,发现不同的组合的受精1.0%-53.6%,杂交后的受精卵的胚胎和幼体均发育正常[5].蔡明夷等认为杂色鲍与盘鲍种间杂交受精率受卵排放后时间和精子浓度的影响比较大,在后续的工作中蔡明夷等又证明了杂色鲍♀×盘鲍♂种间杂交子代实际上是含有少量父本基因的雌核发育体[6-8].孙振兴等发现西氏鲍♀×皱纹盘鲍♂的杂交子代在养殖一年半以后生长速度比皱纹盘鲍自繁子代快9.6%[9-10].郑升阳等对西氏鲍和皱纹盘鲍进行的杂交实验发现受精率仅为14%,但是杂交组合西氏鲍♀×皱纹盘鲍♂幼体的成活率和稚鲍过冬的情况相较于皱纹盘鲍具有显著的优势[11].骆轩等对皱纹盘鲍与西氏鲍种间杂交进行了详细的研究,发现西氏鲍♀×皱纹盘鲍♂的杂交组合受精率为19%-65%、孵化率为76%-85%,反交组合的受精率为22%-83%、孵化率为1%-85%.两种杂交子代在养殖100天后都表现出了显著超出亲本的生长速度,在180天时存活率与纯系亲本相似[12-14].范飞龙等对绿鲍与皱纹盘鲍进行了杂交实验发现杂交子代相较于亲本在生长速度和存活率方面均具有一定的杂种优势[15].

不同地理群体的同种鲍类的种内杂交也能获得很好的杂种优势,是培育优良种类的另一个有效手段.张国范等通过对日本和中国两个群体皱纹盘鲍之间的种内杂交发现,杂交子代的生长速度和成活率比对照群体具有显著的杂种优势,并在此基础上培育出了我国第一个养殖贝类新品种“大连一号”杂交鲍[16].游伟伟等采用日本和台湾两个群体的杂色鲍进行了种内杂交,在其中的一个杂交组合中存活率的杂种优势率达到了40.6%,在回交之后生长速度的杂种优势率达到了48.6%,经过多年的努力培育出了福建省第一个养殖贝类新品种“东优一号”[17].本课题组先后多次从日本引进西氏鲍,并在福建海区进行人工驯养至性腺发育成熟,从2005年11月开始利用西氏鲍与皱纹盘鲍进行种间杂交实验,对二者杂交的可行性进行初步研究,结果表明杂交子代在生长速度及抗逆性上都表现出了一定的杂种优势[18].种间杂交成功与否的前提条件是不同亲本的精卵能否互相识别完成受精过程.皱纹盘鲍与西氏鲍具有较近的亲缘关系和相同的核型(核型均为2n=20m+16sm)[19],二者种间杂交的成功也间接的证明了这点.对于皱纹盘鲍与西氏鲍种间杂交的受精过程还没有报道,因此本研究采用荧光显微技术对皱纹盘鲍与西氏鲍杂交的受精过程以及受精卵早期发育的过程进行观察,将会丰富鲍种间杂交的基础研究,同时也为鲍类科学的杂交育种提供理论支持.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用西氏鲍(代号G)系2003年从日本引进,在福建海区进行驯养至性腺发育成熟.皱纹盘鲍(代号D)系引进来自辽宁省大连外海的底播养殖群体,并已在福建海区连续繁育数代.从以上亲本群体中选择生长发育良好、性腺成熟的个体作为种鲍.

1.2 主要仪器与试剂

奥林巴斯BX51荧光显微镜、0.2M pH7.4 磷酸缓冲液、2%戊二醛、2.5%多聚甲醛、HOECHST33258 (江苏碧云天公司)、FITC-anti-α-tubulin (sigma).

1.3.1 催产与受精

亲鲍催产采用阴干结合紫外线照射过海水刺激的方法,具体的方法是：在16℃-23℃条件下,阴干1小时,流水1小时然后将西氏鲍雌鲍和皱纹盘鲍雄鲍分别置于不同的容器内,注入照射强度为每小时500 mW-800 mW紫外线处理海水,每隔40分钟-60分钟更换一次紫外线处理海水,直至雌雄种鲍产卵和排精为止.待配子开始排放时,迅速将正在排放的亲鲍转移至单独的容器中产卵、排精.操作全过程严防同种精子授精.将获得的皱纹盘鲍与西氏鲍受精卵按正反交分别放置于独立容器之中.

1.3.2 杂交鲍受精过程观察

授精后0-60 min,每隔5 min取样一次;60-150 min,隔10 min取样一次.样品置于2%戊二醛和2.5%多聚甲醛固定液中,更换固定液2次,置于4℃保存.观察时,弃去固定液,用pH7.4的0.2 M磷酸缓冲液清洗2-3次,加适量的HOECHST33258染液于黑暗环境下染色 20 min,使用Olympus BX51荧光显微镜在365 nm的紫外光下观察、拍照.

其中一部分固定好的样品采用FITC-anti-α-tubulin进行免疫荧光染色,将样品置于0.5%的Triton X-100中透化处理30 min之后用200 μg/ml的RNAse在25℃下处理1h.用5%的BSA封闭处理1h,1:50的FITC-anti-α-tubulin染色1h之后用0.01% Triton X-100清洗两次,10μg/ml的PI复染10min.将样品清洗两次后转移到载玻片上(注意不加盖玻片)放在荧光显微镜下观察.采用Image-pro plus 6.0软件对结果进行荧光合成.

受精后取一定量的受精卵放在双凹镜里在显微镜下连续观察,记录极体排放和发生卵裂的时间.

2 结果

2.1 皱纹盘鲍与西氏鲍杂交受精过程观

图1 鲍精子入卵位置

Hoechst与DNA双链中的小沟(minor groove)结合在365 nm的激发光下呈明亮的蓝色荧光,实验结果显示精子、卵子和胚胎中的双链DNA均被染色呈亮蓝色,胞质的背景清晰无干扰.受精卵发育过程中的染色体形态及行为可以被很好地观察到(图1).体外受精的软体动物,精子入卵的时间有两种类型,一种是胚泡存在,初级卵母细胞处于第1次成熟分裂之前;另一种是胚泡消失,初级卵母细胞处于第1次成熟分裂中期[20-22].鲍类的受精过程属于第二种类型,既精子入卵以后,卵子开始两次的减数分裂[23-24].

风险是现代社会的结构性特征，而文明的馈赠就是可靠性——摆脱来自自然的、自身的和他人的危险，获得可靠性。⑦ ［英］齐格蒙·鲍曼著：《寻找政治》，洪涛、周顺、郭台辉译，上海世纪出版集团2006年版，第8页。因此，对于包括知识产权风险在内的各类风险的有效控制，是现代社会和人类文明所面临的重要课题。当然，风险控制有多种路径，对于知识产权风险的控制究竟应当采取何种路径、是否须诉诸于法律，则取决于知识产权风险自身的特征。

本研究中发现有少数的受精卵在显微镜下可以观察到精子在卵膜表面进入卵子的结构,精子呈明亮的蓝色,精子周围卵膜内陷成褶皱孔状(图1).受精后2 min,精子粘附在成熟卵子表面的胶膜上,此时卵子处于第一次减数分裂的中前期(图2a),此时可见卵子染色体位于卵子中央位置.受精后2-5 min,精子完成顶体反应开始进入卵子,由于卵子的胞质作用使精核染色质去致密,同时由于精子的进入卵子开始进行第一次减数分裂,此时可见卵子染色体开始复制分离形成雌性原核与第一极体(图2b).随着受精卵的发育卵子完成第二次减数分裂,排除第二极体(图2c).同时形成早期精卵原核(图2d).精卵原核膨胀并彼此融合,受精卵开始进行有丝分裂完成第一次卵裂(图2.1.2e).胚胎继续发育开始第二次有丝分裂,正常的有丝分裂可见两个细胞的染色体进行复制分离(图2f、图2g).经过多次有丝分裂进入多细胞期(图2h).

图2 皱纹盘鲍♀×西氏鲍♂受精过程的荧光显微观察

2.2 皱纹盘鲍与西氏鲍杂交受精卵免疫荧光染色

鲍的成熟未受精卵表面是一层极薄的质膜,围绕其外的是卵黄膜,卵黄膜的外围是很厚的胶膜,胶膜是由一些不定形物质和分布稀疏的纤维状细丝所组成[25].通过HOECHST33258染色观察受精卵早期发育的过程中发现部分受精卵表面的精子入卵位置有一个褶皱的孔状结构.鲍细胞溶素存在于精子的顶体泡内,当精子粘附到卵黄外膜上时就诱发顶体反应,释放的lysin以二聚体的形式与卵黄膜相结合,随后其单聚体形式利用非酶解反应,在卵黄膜上穿一个直径为3 μm的小孔,直径1 μm精子就从此处穿过卵黄膜与卵细胞融合[26].但是该研究并没有对该结构进行详细的描述,所以有必要对该结构进行更进一步的研究.本研究采用FITC标记的抗α微管蛋白对精子入卵过程进行荧光免疫染色以期对鲍类受精过程及种间杂交提供更多基础数据.

由于鲍类卵子外围包被着一层厚厚的胶状物具有很强的粘附性[27],所以FITC-anti-α-tubulin会有一部分被胶质膜吸附造成浅绿色的荧光背景.荧光染料PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,它是一种溴化乙啶的类似物,在嵌入双链DNA后释放红色荧光.实验结果可以看到由于鲍类细胞外胶膜的影响FITC-anti-α-tubulin探针并不能很好进入卵子,即对细胞内骨架不能有效的标记.本研究中没有观察到理想的纺锤丝等结构.但是在精子进入卵子的位置存在一个可见明亮绿色信号的孔状结构.为了方便说明我们暂称该结构为精孔.实验结果显示杂交鲍的受精卵经过抗α微管蛋白标记后均呈现强烈的绿色信号(图3a).该信号的位置随机出现在卵膜的表面上,也即是说精子进入卵子的位置是随机的不存在特定位置.该结构在卵子胶膜内部发生于卵黄膜上,显微镜下观察该孔状结构附近卵黄膜呈褶皱状内陷,对该结构测量直径大约15 μm(图3b、图3c).精孔形成后精子入卵排出第一极体时可见卵黄膜与质膜之间距离明显变大(图3d).受精卵继续发育排出第二极体(图3e).当受精卵完成第一次和第二次卵裂是仍可见精孔结构存在(图3f、图4a).当受精卵开始第三次卵裂形成8细胞时精孔绝大部分消失(图4b、图4c).

图3 皱纹盘鲍♀×西氏鲍♂受精孔荧光显微观察

图4 皱纹盘鲍♀×西氏鲍♂受精孔荧光显微观察

3 讨论

皱纹盘鲍与西氏鲍杂交过程与皱纹盘鲍自交过程类似,精子入卵之后卵子开始进行第一次减数分裂释放第一极体,精子向雌性原核移动并解凝形成雄性原核.受精卵释放第二极体之后雌性原核融合进行有丝分裂形成第一次卵裂.本研究通HOECHST33258染色杂交鲍受精过程进行跟踪观察表明,来自皱纹盘鲍的大部分异源精子可以顺利的进入西氏鲍的成熟卵子,并且激活卵子恢复并完成二次减数分裂;同时卵子也可激发精子完成去致密等一系列变化.精卵原核的融合以及早期胚胎进行正常发育证实了异源精子参与了后代遗传物质的组成.种间杂交最大的障碍即是种间的生殖隔离,远缘杂交受精不亲和现象十分常见,例如导致雌核发育生殖,如银鲫♀×兴国江鲤♂的杂交精子无法在卵子中膨大形成雄性原核以固缩状的形态存在从而导致雌核发育生殖[28].而皱纹盘鲍♀×西氏鲍♂的种间杂交在适宜的条件下最高可达到81%的受精率,反交亦能达到50%受精率[29].究其原因除了水温、pH、盐度以及卵龄的客观因素之外,最主要的是皱纹盘鲍与西氏鲍的精卵间的识别机制.细胞溶素(lysin)作为在成熟的鲍类精子顶体泡内重要的功能蛋白对两性配子相互识别起着关键作用[30].lysin作为进化速度最快蛋白之一皱纹盘鲍与西氏鲍的lysin完整的cDNA序列几乎完全一致[13],这也在一定程度上解释了皱纹盘鲍与西氏鲍种间杂交出现较高受精率的原因.

种间杂交受精卵的发育存在滞后性和不一致性,皱纹盘鲍与西氏鲍无论正反交组合的受精卵发育均滞后于自交组合,由于不同种类的生物精卵之间的配体受体存在差异,皱纹盘鲍与西氏鲍lysin序列即使十分接近,精卵识别也会经历一个复杂的过程.栉孔扇贝♀×华贵栉孔扇贝♂受精观察中,发现异源核-质及核-核的相互识别协调有一定困难,可能是造成发育迟缓的一个原因[31].杂种受精卵在胚胎发育阶段也出现了发育不一致性.首先是由于生物的个体差异,如精子活力不同,卵子成熟度不一致.在生产实践中我们发现鲍卵子的成熟度十分关键,直接影响到受精率和胚胎发育速度.其次杂交两亲本核质不完全相容,并且核质的分裂节奏不同所导致胚胎发育的不同步.在这种情况下可能造成染色体的异常分离、丢失、加倍、形态改变等现象,进而导致部分受精卵发育的异常,停滞及死亡.

鲍的精子与卵子外胶状膜吸附后到达卵黄膜,卵黄膜表面的lysin受体(VERL)诱发精子发生顶体反应,顶体泡释放蛋白质到卵黄膜,该蛋白使卵黄膜纤毛舒展进而分开产生一个小孔,精子头部顶体与卵细胞膜融合[32].采用FITC标记的抗α微管蛋白能特异的结合在微管蛋白上,实验中观察到每个受精卵都有一个特异的明亮信号,说明在该位置存在着大量的微管结构.卵黄膜可以分为三层,内外两层是由一些极细微的纤维状丝构成.通过实验结果可以确定精孔是由卵黄膜内纤维丝形成的特殊结构.显微镜下观察到精子进入胶膜达到卵膜之后形成一个褶皱内陷的漏斗形结构,通过测量发现该结构在胶膜表面的直径约为15 μm左右,远大于文献[32]报道lysin所钻的直径为3 μm的孔.究其原因可能是精子内的其他成分与胶膜相结合并在尾部游动的作用下接近卵黄膜诱发顶体反应.胶膜的作用对于鲍受精是至关重要的,鲍排除体外的无胶膜卵是不能受精的.这也从侧面验证了精子与卵子识别的过程中胶膜会诱导精子发生一些变化,这种变化极可能是相互的,精子释放物质胶膜被溶解同时精子也更易于发生顶体反应.

精孔结构形成于精子头部与卵黄膜接触之后,大约持续到四细胞期以后消失.精子入卵后,卵子发生皮层反应.卵子皮层中的皮层小泡破裂引起卵膜膨胀,并与卵黄膜形成受精膜.受精膜与质膜之间的间隙称为卵周隙.关于受精膜的形成有两种观点,第一种认为鲍的卵黄膜在受精前已经举起,并且质膜与卵黄膜之间的间隙达数十微米,不存在受精膜举起的现象[33].而孙振兴等人认为鲍受精后皮层反应举起形成受精膜[23].本文研究的结果显示精子入卵之后第一极体排除时卵周隙才明显增大,这与第二种观点是一致的.

一般体外受精的软体动物是单精子入卵,单精受精.本实验采用的材料是皱纹盘鲍与西氏鲍种间杂交的受精卵，在远缘杂交过程中精子的浓度要远高于正常自交精子浓度,另外种间杂交精卵识别十分困难,所以实验中观察到了很多疑似多精入卵的现象.通过对一个多精入卵的四细胞胚胎采用不同焦距的观察发现该胚胎外卵膜上存在多个精孔信号(图4d、图4e),并且该卵子已经发育至四细胞期.说明多精入卵至少并不影响胚胎的早期发育.有报道称在一些软体动物中存在多精入卵的现象,这其中只有一个精子可以形成雄原核与雌原核结合,因此卵子仍可正常发育,其他的多余的精子在卵内被逐渐吸收崩解,但吸收时间因种类不同而异,或在减数分裂期间,或迟至第1次卵裂时才被吸收[22, 34].实验结果显示多精入卵时只有一个精孔的大小为正常大小(图4f),这说明只有一个精子完成了顶体反应.我们推测当第一个精子开始顶体反应时卵黄膜举起形成受精膜,这时卵黄膜发生了一系列变化停止了与其他精子交互反应使精孔不能顺利形成,同时卵周隙增大阻止了其他精子与卵子质膜的接触,不能传递遗传物质进入卵子.

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(编校：李由明)

Cytological Observation on Cross Fertilization ofHalilotisdiscushannaiandHalilotisgiganteawith Fluorescent Microscope

WANG Hai-shan1,2, LU Wen-gang1, YE Le1, LI Wei-dong1, KE Cai-huan2

(1.School of Life Sciences and Ecology, Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan 572022, China;2.Colleges of Ocean and Earth Sciences, Xiamen University, Xiamen Fujian 361005, China)

The current study was conducted on the fertilization process and the early development of fertilized eggs by the fluorescence microscopy technique.The position of sperm into the eggs was labeled by FITC-anti-α-tubulin.The results showed that sperm ofH.giganteapenetratedH.discushannaieggs.The first cleavage and the first polar body were released in after 2-5min of sperm-egg fusion.With the completion of the second meiotic division of the fertilized egg, the second polar body was released, forming the early male and female pronucleus.Then two pronucleus began to swell and started mutual fusion, and the fertilized eggs began to undergo mitosis to complete the first cleavage.The immunofluorescent observation with the FITC labeled anti-α-tubulin probe detected a pore structure similar to micropylar on the surface of egg membrane.

crossbreeding abalones; fertilization; fluorescent observation

格式：王海山,吕文刚,叶乐,等.皱纹盘鲍与西氏鲍杂交受精过程荧光显微观察[J].海南热带海洋学院学报，2017，24(2)：1-6+73.

2017-03-03

海南省高等学校科学研究项目(HNKY2016-43)

王海山(1983-),男,辽宁葫芦岛人,海南热带海洋学院生命科学与生态学院讲师,博士,研究方向为海洋生物多样性.

Q75

A

2096-3122(2017) 02-0001-06

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.02.01