MAPK信号通路在高糖高脂诱导的心肌细胞肥大中的差异调节作用

闫佳敏+王瑞玲+马琴+崔桂丽+王亚静

【摘要】 目的：探讨丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路在高糖高脂诱导的H9c2细胞肥大中的作用。方法：高糖（33 mmol/L）及不同浓度脂（250、500、1000 ?mol/L）不同时间（12、24、36、48 h）干预H9c2细胞，应用乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测细胞培养液中LDH的活性，采用RT-PCR技术分别检测肥厚指标心房钠尿肽（ANP）、α-心肌肌动蛋白（α-SKA）的mRNA表达，利用蛋白免疫印迹（Western blot）技术检测p-ERK/T-ERK、p-JNK/T-JNK、p-p38/T-p38的活化程度。结果：结果显示上清LDH的活性与高糖高脂处理间具有浓度及时间依赖性，高糖高脂显著增加ANP和α-SKA的mRNA表达（P<0.05），在高糖高脂（33 mmol/L+500 ?mol/L）36 h时ANP、α-SKA的mRNA表达最高（P<0.01）。与对照组相比，高糖高脂显著促进MAPK信号活化，其中p-ERK和p-JNK的活化分别增加了1.39倍和1.47倍（P<0.05），而p-p38活化增加了3.34倍（P<0.01）。结论：高糖高脂可导致H9c2细胞损伤并显著促进细胞肥大，在此过程中MAPK信号通路差异调控作用扮演重要角色。

【关键词】 H9c2； 高糖高脂； 心肌肥厚； 糖尿病心肌病； MAPK

The Role of MAPK Signaling Pathway in Diabetic Cardiomyopathy/YAN Jia-min，WANG Rui-ling，MA Qin，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（10）：005-009

【Abstract】 Objective：To investigate the role of mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathway in high glucose and high fat induced hypertrophy of H9c2 cells.Method：H9c2 cells were treated with high glucose（33 mmol/L） and different concentrations of lipids（250，500，1000 μmol/L） at different time （12，24，36，48 h）.The activity of LDH in cell culture medium was detected by lactate dehydrogenase（LDH） kit.Quantitative Real-time PCR（RT-PCR） was used to detect the mRNA expression of atrial natriuretic peptide （ANP） and α-skeletal muscle actin （α-SKA） in hypertrophic myocardium.The activation of p-ERK/T-ERK，p-JNK/T-JNK and p-p38/T-p38 were detected by Western blot.Result：The results showed that the activity of supernatant LDH was concentration and time dependent with high glucose and high lipid treatment.Hyperglycemia and hyperlipidemia significantly increased the mRNA expression of ANP and α-SKA，the mRNA expression of ANP and α-SKA was the highest at high glucose and high fat （33 mmol/L+500 μmol/L） for 36 h（P<0.05）.Compared with the control group，high glucose and high fat significantly promoted MAPK activation.Among them the activation of p-ERK and p-JNK were increased by 1.39-fold and 1.47-fold（P<0.05），while p-p38 activation was increased by 3.34-fold（P<0.01）.Conclusion：High glucose and high fat can cause H9c2 cell damage and promote cell hypertrophy，in which MAPK signal pathway play an important role in the regulation of differences.

【Key words】 H9c2； HGHL； Myocardial hypertrophy； DCM； MAPK

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.10.002

糖尿病是心血管系統疾病发病的重要危险因素，糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是一种以心肌肥大、心肌纤维化、细胞水平钙转运缺陷、心肌收缩蛋白胶原形成和脂肪酸代谢异常等为特征的一种独特的心肌病变[1-3]。其发病机制复杂，可能涉及代谢紊乱（如葡萄糖转运子活性下降、游离脂肪酸增加、胰岛素抵抗等）、微血管病变、心脏植物神经功能紊乱及心肌纤维化（与高血糖、心肌细胞凋亡、炎性细胞因子等有关）等多种因素的一种，是病因尚不明确的糖尿病主要合并症之一[4-6]。丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，是一类广泛存在于真核细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶，在DCM的发生发展过程中起到重要作用，其中MAPK成员p38、JNK信号主要介导细胞凋亡和炎症等，而ERK介导细胞增殖增生等[7-9]。越来越多的实验证据表明，MAPK信号家族在心肌肥大的启动以及心肌肥大病理进程中起重要作用[10]。据此本研究采用高糖高脂处理的H9c2病理变化模型，探讨病理进程中MAPK家族如何发挥作用，即凋亡信号及增生信号是如何变化的。本研究旨在通过探讨MAPK家族与糖尿病心肌病之间的关系，试图阐明凋亡与增生变化规律，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠胚胎心肌细胞H9c2（北纳创联生物技术研究院，北京）；DMEM高糖培养基、青链霉素混合液、PBS缓冲液、0.25%胰蛋白酶（博士德生物工程有限公司，武汉）；胎牛血清（Gibco公司，美国）；葡萄糖D-GLUCOSE（索莱宝生物科技有限公司，北京）；棕榈酸钠Sodium palmitate（Sigma，美国）；乳酸脱氢酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京）；Trizol总RNA提取试剂、RT-PCR测定试剂盒、RNA引物合成（TaKaRa，日本）；无RNA酶枪尖、氯仿、乙醇、DEPC、八联管等（生工生物工程股份有限公司，上海）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天，上海）；单克隆兔抗p-JNK、p-p38、t-p38抗体、多克隆兔抗p-ERK、t-JNK、t-ERK（CST公司，美国）；辣根过氧化物酶标记的二抗（中杉金桥生物技术有限公司，北京）；Western blotting 发光液（爱必信生物科技有限公司，上海）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理 H9c2心肌细胞来源于大鼠胚胎期心脏组织，接种于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，将其置于5% CO2、37 ℃孵箱进行培养，待细胞生长至70%～80%进行实验干预。实验分为4组：正常对照组，高糖高脂A组（33 mmol/L葡萄糖+250 ?mol/L棕榈酸钠），高糖高脂B组（33 mmol/L葡萄糖+500 ?mol/L棕榈酸钠），高糖高脂C组（33 mmol/L葡萄糖+1000 ?mol/L棕榈酸钠）。

1.2.2 乳酸脱氢酶测定试剂盒检测LDH的活性 于六孔板中种植H9c2心肌细胞，待细胞融合度达到70%～80%时，按照分组给予不同处理后，在不同时间收集。操作流程根据试剂盒说明书进行，操作结束后用酶标仪测定各孔450 nm处的吸光度值计算其活力。

1.2.3 Real-time PCR检测ANP、α-SKA的mRNA的表达 按照Trizol说明书步骤提取细胞总RNA，采用分光光度计检测RNA样品的A260/A280比值在1.8～2.0，以确定RNA纯度，并计算出RNA的浓度。参照RT-PCR试剂盒说明书进行反转录，将反转录管放于PCR仪中进行逆转录反应，逆转录反应参数：37 ℃ 15 min（反转录反应），85 ℃ 5 s（反转录酶的失活反应），4 ℃。两步法进行PCR扩增反应，RT-PCR扩增的引物序列（表1），按照说明书加入SYBR荧光染料、引物序列以及反转录后的产物，在Mx 3000p荧光定量PCR仪（Stratagene） 上进行，扩增反应参数为：预变性：95 ℃，30 s，1个循环；PCR反应：95 ℃ 5 s、60 ℃ 30～34 s，40个循环。每组样品设置3个复孔以保证实验结果的有效性、重复性和准确性。

1.2.4 Western blot检测高糖高脂干预H9c2心肌细胞24 hp-ERK、p-JNK、p-p38的蛋白表达量 H9c2心肌细胞接种于六孔板中，培养至70%～80%满时分为两组：正常对照组和高糖高脂B组，给予不同的处理，然后待处理时间为24 h时弃去培养液，用预冷的PBS洗两次，加入配好的裂解液进行裂解并收集于离心管中进行超声破碎和离心。然后用BCA法测定蛋白浓度调整相应的上样量制备好蛋白样本。95 ℃煮5 min变性，制备12%SDS分离胶和5%浓缩胶进行电泳从而分离蛋白质，电泳结束后使用半干转将已分离的蛋白质转印至PVDF膜上，然后再用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。封闭结束后用TBST洗膜3次，5 min/次，將膜置于相应的一抗稀释液（1∶1000）中4 ℃摇床过夜。次日取出膜用TBST洗膜3次，5 min/次，将膜置二抗稀释液（1∶10 000）中于摇床上室温孵育1 h，洗膜后即可进行ECL发光法显影。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行数据的分析处理，计量资料采用（x±s）表示，先进行数据的正态性检验、方差齐性检验，符合上述条件者行单因素方差分析比较多组间的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间对H9c2细胞中LDH活力的影响 高糖高脂处理H9c2，细胞上清LDH的活性呈浓度及时间依赖性，随着浓度和时间的逐渐增加，上清LDH的活性与高糖高脂处理间呈浓度及时间依赖性（P<0.05），见表2。

2.2 高糖高脂可增加H9c2细胞中ANP mRNA水平的表达 随着浓度和时间的逐渐增加，ANP的表达也逐渐升高，且在高糖高脂B组（33 mmol/L葡萄糖+500 ?mol/L棕榈酸钠）干预细胞36 h时ANP表达量达到高峰（P<0.01）。见表3。

2.3 高糖高脂促进α-SKA mRNA的表达 相比对照组而言，高糖高脂促进α-SKA 的表达，且在36 h高糖高脂B组其表达达到最高（P<0.05），这与ANP的结果一致，据此确定高糖中浓度脂干预细胞36 h为干预浓度和时间，见表4。

2.4 高糖高脂可诱导MAPK蛋白磷酸化 相比对照组，高糖高脂B组干预24 h MAPK家族成员p38、ERK、JNK磷酸化水平均增高，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。其中p-ERK的活化水平增加了约1.39倍（0.96±0.16 vs 0.69±0.04），p-JNK的活化水平增加了约1.47倍（1.05±0.21 vs 0.78±0.09），而p-p38的活化水平相对于对照组增加了约3.34倍（2.35±0.35 vs 0.71±0.14），见图1。

3 讨论

糖尿病心肌病是在1972年由Rubler等首先提出的，糖尿病心肌病的定义为有明确糖尿病病史，同时有明确的心肌结构和功能改变，排除缺血性疾病、高血压及其他可能引起心肌病变的疾病[11-13]。本实验通过离体实验用高糖高脂将正常心肌细胞处理作为体外糖尿病心肌病模型，证实：高糖高脂可诱发心肌肥大，进而导致心肌结构改变；在心肌肥大的发生及发展过程中MAPK信号家族具有重要作用。

糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素、生活方式等各种原因导致机体持续高血糖高血脂以及长期代谢紊乱综合征[14-15]。高糖高脂持续状态下，细胞外基质大量增生、胶原降解异常以及心肌间质纤维化，纤维化的增加直接促进成纤维细胞增殖，导致心肌肥大和重构，心脏功能受限[16]。目前已有研究利用高糖及不同浓度高脂干预H9c2心肌细胞建立糖尿病心肌病模型，通过检测特异性基因A型心房钠尿肽（ANP）和α-心肌肌动蛋白（α-SKA）来确定模型的建立成功[17]。据此笔者采用高糖（33 mmol/L）

及不同浓度高脂（250、500、1000 ?mol/L）干预细胞，从而检测ANP、α-SKA的表达。相比对照组，高糖高脂显著增加ANP和α-SKA的mRNA表达，在高糖高脂（33 mmol/L+500 ?mol/L）36 h时ANP、α-SKA的mRNA表达最高，因此成功建造了体外糖尿病心肌病模型。

MAPK主要有3个亚组：细胞外信号调节激酶1/2（Extracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2）、p38、c-Jun氨基端激酶/应激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinase，JNK/SAPK）。每条信号通路都具有高度特异性，具有独立的功能，在某些程度上几条信号通路间存在着一定的关联，很多刺激因素如缺血、缺氧、激素、细胞因子、细胞应激等各种细胞外刺激均可诱导其激活，从而成为细胞增殖、分化、凋亡等与生理过程密切相关的核反应共同通路或汇聚点[18]。有研究已表明ERK主要参与介导细胞的生长、分化、发育、增殖等生理病理过程；而p38和JNK则与细胞炎症、凋亡、生长、分化、应激反应等过程有关[19-20]。在此实验中，笔者检测到在糖尿病心肌病的发生发展过程中ERK、JNK、p38均被激活，且p38的活化水平增加最显著。这提示笔者p38主导凋亡过程同时伴随ERK活化而促进细胞增生的现象很有可能是引起DCM发生发展过程中的重要环节。但细胞内的信号通路是一个复杂的网络系统，是否有其他通路在DCM的发展过程中发挥作用还需通过大量研究来进一步说明。

综上所述，笔者通过探讨MAPK在由高糖高脂诱导的H9c2心肌细胞肥厚过程中的作用，揭示以凋亡信号为主导的细胞凋亡通路及增生通路并存在其中扮演重要角色，从而在机理方面为DCM的治疗提供新的思路，最终为糖尿病心肌病的预后提供新的靶点。

参考文献

[1]周彬，钱孝贤.糖尿病心肌病的研究进展[J].新医学，2010，41（3）：197-199.

[2]冯新星，陈燕燕.糖尿病心肌病的研究进展[J].中国循环杂志，2015，30（1）：87-89.

[3]高嵩，危春英.糖尿病心肌病发病机制及对心功能影响的研究进展[J].医学综述，2011，17（18）：2796-2799.

[4] Poornima I G，Parikh P，Shannon R P.Diabetic cardiomyopathy：the search for a unifying hypothesis[J].Circ Res，2006，98（5）：596.

[5] Wende A R，Abel E D.Lipotoxicity in the heart[J].Biochim Biophys Acta，2010，1801（3）：311-319.

[6] Lloyd-Jones D，Adams R J，Brown T M.Executive summary：heart disease and stroke statistics-2010 update：a report from the American Heart Association[J].Circulation，2010，121（7）：948-954.

[7]王文聪，谢春毅.丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号通路与糖尿病心肌病关系的研究进展[J].当代医学，2016，22（14）：8-10.

[8]王誉霖，张励才.p38MAPK信号转路与细胞凋亡研究进展[J].慢性病学杂志，2010，12（12）：1665-1667

[9] Lijnen P，Petrov V，Rumilla K.Transforming growth factor-beta 1 promotes contraction of collagen gel by cardiac fibroblasts through their differentiation into Myofibroblasts[J].Methods Find Exp Clin Pharmacol，2003，25（2）：79-86.

[10] Ravingerova T，Barancik M，Strniskova M.Mitogen-activated protein kinases：a new therapeutic target in cardiac pathology[J].Mol Cell Biochem，2003，247（1）：127-128.

[11]劉晓禹，万沁.Nrf2-ARE信号通路与2型糖尿病心肌病的相关研究[J].中外医学研究，2013，11（26）：154-155.

[12] Goyal B R，Mehta A A.Diabetic cardiomyopathy：pathophysiological mechanisms and cardiac dysfunction[J].Hum Exp Toxicol，2013，32（6）：571-590.

[13]丁文龙，潘大彬.内质网应激在糖尿病心肌病发病机制中的作用[J].承德医学院学报，2016，33（4）：336-339.

[14]黄娅茜，王宪，孔炜.糖尿病性疾病发病机制的研究进展[J].生理科学进展，2010，41（1）：31-36.

[15]郭世彪，程春梅.抗糖尿病药物的研究现状与展望[J].中国药物与临床，2014，14（8）：1066-1068.

[16] Moreira L F，Benicio A，Bacal F，et al.Determinants of long-term mortality of current palliative surgical treatment for dilated cardiomyopathy[J].Eur J Cardiothorac Surg，2003，23（5）：756-764.

[17] Xiaoyu Wang，Susan V，McLennan.Adverse effects of high glucose and free fatty acid on cardiomyocytes are mediated by connective tissue growth factor[J].Am J Physiol Cell Physiol，2009，297（6）：C1490-C1500.

[18]贾林，林智峰，马莉.P38MAPK抑制剂SB203580对高糖诱导HK-2细胞转分化的影响[J].天津医药，2016，44（4）：426-429.

[19]陈建勇，王聪，王娟.MAPK信号通路研究进展[J].中国医药科学，2011，1（8）：32-34.

[20] Ding F，Yu L，Wang M.O-Glc NAcylation involvement in high glucose-induced cardiac hypertrophy via ERK1/2 and cyclin D2[J].Amino Acids，2013，45（2）：339-349.