BIIB021对MDS细胞株Skm-1增殖的多靶点抑制作用研究

李静 沈益民 林圣云 陈珍珍

●论 著

BIIB021对MDS细胞株Skm-1增殖的多靶点抑制作用研究

李静 沈益民 林圣云 陈珍珍

目的 探讨热休克蛋白90（HSP-90）抑制剂BIIB021对骨髓增生异常综合征（MDS）细胞株Skm-1增殖的多靶点抑制作用。方法 分别将0、100、200、400nmol/L BIIB021作用于4组Skm-1细胞（对照组、100 nmol/L组、200 nmol/L组、400 nmol/L组），培养24h后采用Western blot法检测各组细胞雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、mTOR复合物1（mTORC1）、低氧诱导因子-1α（HIF-1α)蛋白表达水平。 结果 各组Skm-1细胞mTOR蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组Skm-1细胞mTORC1、HIF-1α蛋白表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；组间两两比较差异亦均有统计学意义（均P＜0.05），即100 nmol/L组、200 nmol/L组、400 nmol/L组Skm-1细胞mTORC1、HIF-1α蛋白表达水平均低于对照组，且400 nmol/L组表达水平最低。 结论 BIIB021通过抑制mTORC1和HIF-1α蛋白的表达抑制Skm-1细胞增殖。

HSP-90 骨髓增生异常综合征 mTORC1 HIF-1α

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性、克隆性造血干细胞疾病，其主要特征是骨髓中原始细胞增多伴一系或多系发育异常（病态造血），并具有向急性白血病转化的高风险。由于MDS的异质性，临床对部分非典型MDS患者的诊断及预后评估存在困难；且MDS化疗疗效不佳，目前普遍认为其是不可治愈的。近年来，化疗药物地西他滨的应用及骨髓移植治疗的开展虽挽救了小部分MDS患者的生命，但医疗费用昂贵、不良反应大、有效率低，大部分患者病情恶化死亡。因此，临床迫切需要高效的药物应用于MDS的治疗。笔者团队前期研究发现，热休克蛋白90（HSP-90）抑制剂BIIB021能显著抑制MDS细胞株Skm-1细胞增殖，并引起细胞凋亡[1]。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、mTOR复合物1（mTORC1）、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）是HSP-90介导的信号通路靶点蛋白。基于此，本研究将不同浓度BIIB021作用于 Skm-1细胞，采用 Western blot法检测 mTOR、mTORC1、HIF-1α蛋白表达水平，旨在探讨BIIB021对Skm-1细胞增殖的多靶点抑制作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 MDS细胞株Skm-1由浙江大学医学院附属第一医院惠赠；BIIB021购自美国Selleck Chemicals公司，用二甲基亚砜（DMSO，美国Cell-Signaling Technology公司）溶解为浓度1mmol/L，－20℃保存；胎牛血清、RPMI 1640购自美国Gibco公司，mTORC1、HIF-1α抗体购自美国Cell-Signaling Technology公司，BCA蛋白定量试剂盒购自以色列Biological Industries公司。

1.2 细胞培养 将Skm-1细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中，在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度中培养。

1.3 Western blot法检测mTOR、mTORC1、HIF-1α蛋白表达水平 取对数生长期Skm-1细胞，分别悬浮于10%FBS的RPMI 1640培养液中，按1×105个/ml的密度接种于培养瓶，使每瓶终体积为10ml。加入不同体积的BIIB021使4组药物浓度分别为0、100、200、400nmol/L（对照组、100nmol/L组、200nmol/L组、400nmol/L组），37℃、5%二氧化碳培养箱中培养24h。1 000r/min离心5min收集各组细胞，加入裂解液冰上放置30min，超声波细胞粉碎机处理后（160W，持续5s，间隔5s，工作5次），4℃，12 000r/min离心15min，收集细胞及其上清液于1.5ml离心管中，BCA法测定蛋白浓度，取45μg蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，开始电压为60V，待蛋白样品进入分离胶后，将电压增至120V。电泳结束后，400mA恒流湿转100min将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入一抗4℃摇床过夜，用1×TBST洗去非特异性结合的蛋白，加入二抗，室温温育2h，再用1×TBST洗膜3次，每次10min，用ECL化学发光底物显色，X线曝光后显影定影。每个蛋白检测重复3次，以β-actin为内参，用ImageJ软件测量蛋白条带灰度值，取平均值。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件；计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采取LSD-t检验。

2 结果

各组Skm-1细胞mTOR、mTORC1、HIF-1α蛋白表达水平比较见图1、表1。

图1 各组S k m-1细胞m T O R、m T O R C 1、H I F-1 α蛋白表达电泳图

由图1、表1可见，各组Skm-1细胞mTOR蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组Skm-1细胞mTORC1、HIF-1α蛋白表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；组间两两比较差异亦均有统计学意义（均P＜0.05），即100 nmol/L组、200 nmol/L组、400 nmol/L组Skm-1细胞mTORC1、HIF-1α蛋白表达水平均低于对照组，且400 nmol/L组表达水平最低。

表1 各组S k m-1细胞m T O R、m T O R C 1、H I F-1 α蛋白表达水平比较（灰度值）

3 讨论

HSP-90是很有前景的肿瘤治疗靶点[2]。既往研究发现，HSP-90在MDS患者中高表达会影响疾病预后，并会使转化为白血病的风险增高[3]。BIIB021是第一代人工合成的HSP-90抑制剂，有研究报道称HSP-90抑制剂BIIB021对实体肿瘤和某些恶性血液系统疾病有较明显的抑制作用，并已进入临床研究阶段[4]。笔者团队前期实验研究发现不同浓度（100、200、400nmol/L）BIIB021作用于Skm-1细胞后能够明显抑制细胞增殖，24、48h的细胞半抑制浓度分别为355.69、168.6 nmol/ L，并通过磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K/Akt）、核因子κB（NF-κB）作用促进Skm-1细胞凋亡。本研究是在前期实验的基础上，通过Western blot法检测BIIB021作用于Skm-1细胞后的mTOR、mTORC1、HIF-1α蛋白表达水平；结果显示不同浓度（100、200、400 nmol/L）BIIB021作用于Skm-1细胞后均能明显下调HIF-1α、mTORC1蛋白的表达水平，而对mTOR蛋白表达水平无明显影响。

HIF-1由HIF-1α和HIFβ两个亚单位组成，研究表明以HIF-1α升高为表现的骨髓微环境异常跟MDS疾病进展及转化有关[5]。mTOR在生物体内以两种复合物的形式存在，即mTORC1和mTORC2。mTORC1既能被蛋白激酶B（Akt）激活，也能通过下游产物S6K1对Akt进行负反馈调节，PI3K/AKT/mTOR信号通路可调节细胞增殖、分化、存活和迁移等功能；这条通路的活性异常不仅能导致细胞恶性转化，还与肿瘤细胞的侵袭转移行为相关[6]；此外这条通路还可通过抑制HIF-1α蛋白的合成、减少HIF-1α蛋白的转录和核转录以及增加HIF-1 mRNA的降解来达到抑制肿瘤生长的作用[7-8]。

综上所述，BIIB021通过抑制mTORC1和HIF-1α蛋白的表达抑制Skm-1细胞增殖，其具体的作用机制有待于临床进一步深入研究。

[1]Lin S,Li J,Zhou W,et al.BIIB021,an Hsp90 inhibitor,effectively kills a myelodysplastic syndrome cell line via the activation of caspases and inhibition of PI3K/Akt and NF-κB pathway proteins[J].Exp Ther Med,2014,7(6):1539-1544.

[2]Isaacs J S,Xu W,Neckers L.Heat shock protein 90 as a molecular target for cancer therapeutics[J].Cancer Cell,2003,3(3): 213-217.

[3]Flandrin P,Guyotat D,Duval A,et al.Significance of heat-shock protein(HSP)90 expression in acute myeloid leukemia cells[J]. CellStress Chaperones,2008,13(3):357-364.

[4]Flandrin-Gresta P,Solly F,Aanei C M,et al.Heat Shock Protein 90 is overexpressed in high-risk myelodysplastic syndromes and associated with higher expression and activation of Focal Adhesion Kinase[J].Oncotarget,2012,3(10):1158-1168.

[5]Didelot C,Lanneau D,Brunet M,et al.Anti-cancer therapeutic approaches based on intracellular and extracellular heat shock proteins[J].Current Medicinal Chemistry,2007,14(27):2839-2847.

[6]Laplante M,Sabatini D M.mTOR signaling in growth control and disease[J].Cell,2012,149(2):274-293.

[7]Karar J,Cerniglia G J,Lindsten T,et al.Dual PI3K/Mtor inhibitor NVP-BEZ235 suppresses hypoxia-inducible factor(HIF)-1αexpression by blocking protein translation and increases cell death under hypoxia[J].Cancer BiolTher,2012,13(11):1102-1111.

[8]Jeong W,Rapisarda A,Park S R,et al.Pilot trial of EZN-2968,an antisense oligonucleotide inhibitor of hypoxia-inducible factor-1 alpha(HIF-1α),in patients with refractory solid tumors[J].Cancer Chemother Pharmacol,2014,73(2):343-348.

BIIB021 inhibits proliferation of myelodysplastic syndrome Skm-1 cells and its mechanism

LI Jing,SHEN Yimin,LIN Shengyue,

et al.Department of Emergency，Zhejiang Hospital,Hangzhou 310013,China

Objective To investigate the effect of HSP-90 inhibitor BIIB021 on the proliferation of myelodysplastic syndrome(MDS)Skm-1 cells and related mechanisms.Methods Skm-1 cells were treated with 100,200 and 400nmol/l BIIB021 for 24h.The expression of proteins mTOR,mTORC1,HIF-1α in Skm-1 cells was examined by Western blot. Results The expression of protein mTOR in Skm-1 cells was not significantly changed after treatment with different concentrations of BIIB021 (P＞0.05).Compared to control group,the expression of mTORC1 and HIF-1α in Skm-1 cells treated with different concentrations of BIIB021 was significantly decreased(P＜0.05),and the expression was the lowest in the group of 400 nmol/L. Conclusion BIIB021 inhibits proliferation of MDS Skm-1 cells through down-regulating the expression of mTORC1 and HIF-1α.

HSP-90 MDS mTORC1 HIF-1α

2 0 1 6-0 7-0 3）

（本文编辑：李媚）

10.12056/j.issn.1006- 2785.2017.39.8.2016- 1016

3 1 0 0 1 3杭州，浙江医院急诊科

李静，E-m a i l：l i j i n g 1 1 8 8 3 0@1 2 6.c o m