高糖腹膜透析液对HPMECs中GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF表达的影响研究

聂振禹 洪梦琪 包蓓艳 李国富 陈争跃 余雄伟

高糖腹膜透析液对HPMECs中GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF表达的影响研究

聂振禹 洪梦琪 包蓓艳 李国富 陈争跃 余雄伟

目的 探讨高糖腹膜透析液对人腹膜微血管内皮细胞（HPMECs）中GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF表达的影响。方法 体外培养HPMECs并分为5组，N组用含葡萄糖的无酚红RPMI-1640培养基培养；P组用2.5%葡萄糖腹膜透析液培养；GN组用含50g/ml葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）拮抗剂根皮素的2.5%葡萄糖腹膜透析液培养；SN组用含10g/ml钠-葡萄糖共转运载体1（SGLT1）拮抗剂根皮苷的2.5%葡萄糖腹膜透析液培养；GN+SN组用含50g/ml根皮素和含10g/ml根皮苷的2.5%葡萄糖腹膜透析液培养。分别采用RT-PCR法、Western blot法检测各组HPMECs GLUT1、SGLT1、细胞因子转化生长因子-β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子-A（VEGF-A）、结缔组织生长因子（CTGF）的mRNA、蛋白表达水平。 结果 5组HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的mRNA、蛋白表达水平比较均有统计学差异（均P＜0.05）。与N组比较，P组HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的mRNA、蛋白表达水平均升高（均P＜0.05）；与P组比较，GN组、SN组、GN+SN组HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的mRNA、蛋白表达水平均降低（均P＜0.05）。 结论 高糖腹膜透析液或通过上调HPMECs中GLUT1、SGLT1的表达，进而上调TGF-β1、VEGF-A、CTGF的表达，从而起促腹膜纤维化作用。

腹膜微血管内皮细胞 葡萄糖转运蛋白1 钠-葡萄糖共转运载体1 细胞因子转化生长因子-β1 血管内皮生长因子-A 结缔组织生长因子

腹膜透析是终末期肾病患者的一种有效治疗方法[1]。尽管在过去的几十年间，透析技术已有很大发展，但腹膜透析患者的生存率仍不理想。腹膜纤维化所导致的超滤衰竭是患者不得不中止腹膜透析的常见原因，而慢性腹膜炎症及高糖透析液对腹膜的损伤是导致腹膜纤维化的两个重要原因[2]。腹膜透析相关性腹膜纤维化的发生是一个复杂的病理发展过程[3]，如肾素-血管紧张素-醛固酮系统、细胞因子转化生长因子-β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）、结缔组织生长因子（CTGF）等发挥的作用，以及内皮细胞中存在的葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）[4]和钠-葡萄糖共转运载体1（SGLT1）[5]也与这一过程密切相关。GLUT1与SGLT1在各种细胞中抗纤维化方面的作用受到临床关注[6-7]。本研究拟通过体外培养人腹膜微血管内皮细胞（HPMECs），探讨高糖腹膜透析液对HPMECs中GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGFA、CTGF表达的影响，以期为探讨腹膜纤维化的发生机制及治疗靶点提供新的理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料 改良型PMI-1640培养基（美国Hyclone公司）；无酚红RPMI-1640培养基、0.25%EDTA-胰蛋白酶、FBS（美国Gibco公司）；2.5%葡萄糖腹膜透析液（广州百特医疗有限公司）；根皮素、根皮苷原粉（美国Sigma公司）；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；GoTaq两步法RT-qPCR系统、GoScript逆转录酶系统、GoTaqRqPCR Master Mix（美国Promega公司）；Trizol试剂（美国Ambion公司）；兔抗人GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF抗体（美国Santa Cruz公司）；荧光标记的羊抗兔Ⅱ抗（美国LICOR公司）；BCA法蛋白定量试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；HPMECs由宁波大学润良糖尿病研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将HPMECs接种在1%明胶包被的25cm2培养瓶中，置于37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养，24～36h后第1次换液，以后每2～3d换液1次。当细胞生长融合至80%～90%时，用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化，以1∶3传代培养，取第3、4代用于实验。

1.2.2 实验分组 将细胞分成5组：N组用含葡萄糖的无酚红RPMI-1640培养基培养；P组用2.5%葡萄糖腹膜透析液培养；GN组用含50g/ml GLUTI拮抗剂根皮素的2.5%葡萄糖腹膜透析液培养；SN组用含 10g/ml SGLT1拮抗剂根皮苷的2.5%葡萄糖腹膜透析液培养；GN+SN组用含50g/ml根皮素和含10g/ml根皮苷的2.5%葡萄糖腹膜透析液培养。

1.2.3 RT-PCR法检测GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGFA、CTGF mRNA表达水平 当细胞生长融合至90%～95%时，按上述分组要求同步培养细胞48h，采用Trizol一步法抽提细胞总RNA，用GoScript逆转录酶系统试剂盒合成cDNA，产物用GoTaq两步法RT-qPCR系统试剂盒进行PCR扩增。PCR反应条件为95℃10s，95℃30s，60℃ 60s，72℃ 60s，共40个循环，采用2-△△Ct法分析RT-PCR结果，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot法检测 GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表达水平 当细胞生长融合至90%～95%时，按上述分组要求同步培养细胞48h，提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，配置5%的浓缩胶和12%的分离胶，取50g变性蛋白进行SDS聚丙烯胺凝胶电泳，并用0.22m的硝酸纤维素滤膜进行蛋白质转膜，考马斯亮蓝染胶、丽春红S染液染膜，观察蛋白质是否转移完全。用含5%牛血清白蛋白的封闭液进行封闭，Ⅰ抗（1∶500）4℃孵育过夜，随后荧光标记的羊抗兔Ⅱ抗（1∶10 000）室温避光孵育1h，Licor Odyssey红外成像系统扫描实验结果，最后分析各目的蛋白条带与β-actin蛋白条带灰度值作为蛋白表达水平。

1.3 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件；计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 5组HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF mRNA表达水平比较 见图1。

图1 5组H P M E C s G L U T 1、S G L T 1、T G F-β1、V E G F-A、C T G F m R N A表达水平比较

由图1可见，5组HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF mRNA表达水平比较均有统计学差异（均P＜0.05）。与N组比较，P组HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF mRNA表达水平均升高（均P＜0.05）；与P组比较，GN组、SN组、GN+SN组 HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF mRNA表达水平均降低（均P＜0.05）。

2.2 5组HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表达水平比较 见图2。

图2 5组H P M E C s G L U T 1、S G L T 1、T G F β-1、V E G F-A、C T G F蛋白表达水平比较

由图2可见，5组HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表达水平比较均有统计学差异（均P＜0.05）。与N组比较，P组HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表达水平均升高（均P＜0.05）；与P组比较，GN组、SN组、GN+SN组HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表达水平均降低（均P＜0.05）。

3 讨论

目前国内腹膜透析常规使用不同浓度葡萄糖为渗透剂的乳酸盐透析液。高糖在腹膜内异常代谢所产生的晚期糖基化终产物或葡萄糖降解产物可促进细胞外基质的分泌、沉积，最终导致腹膜纤维化，其中葡萄糖的吸收可能随治疗时间的延长而增加。葡萄糖的吸收会导致渗透梯度的减小或消失加快，超滤量减少，同时可能导致高血糖、高胰岛素血症、高脂血症、高血压、体重增加等代谢紊乱。因此获得最佳超滤以及减少对腹膜功能损伤的同时，减少葡萄糖的吸收，进而减少代谢紊乱是腹膜透析治疗的理想目标。高糖所致的细胞损伤、代谢紊乱，细胞内糖摄入过多是启动因素。

高糖必须借助葡萄糖转运蛋白进入细胞内才能发挥其毒性作用。细胞对葡萄糖的吸收摄取途径有两种[8-9]：一是载体介导的易化扩散，二是继发性主动转运，通过钠泵的存在，促进葡萄糖逆浓度梯度转运。其中易化扩散转运的主要载体是GLUT，而继发性主动转运主要依靠SGLT介导。GLUT是细胞转运葡萄糖的载体，是调控细胞糖代谢的第一道关卡。GLUT功能异常势必会影响细胞内糖代谢，从而导致代谢紊乱。研究发现，GLUT有很多亚型，包括GLUT1、2、3、4、5等，而SGLT主要有SGLT1、2、3。据报道，在人视网膜的血管内皮细胞上存在着GLUT1、3，在体外培养的HPMCs上有3种GLUT。其中GLUT1是介导HPMCs葡萄糖摄取的主要转运蛋白，高糖可上调间皮细胞上GLUT1蛋白的表达。而GLUT1表达上调或者活性增加使细胞对葡萄糖摄取过多，造成细胞内糖负荷过重和糖代谢紊乱，进而导致腹膜损伤、细胞外基质沉积，加重腹膜炎症，最终导致腹膜纤维化。同时其表达上调将增加HPMCs对葡萄糖的摄取，降低超滤率[10-11]。高糖对不同细胞上的GLUT的作用是不同的：在视网膜周细胞中，它可以降低GLUT的转运活性而在内皮细胞没有这种功能[12]，同时GLUT位置的改变会导致功能的改变[13-14]。本研究发现2.5%葡萄糖腹膜透析液可以促进HPMCs GLUT1、SGLT1表达水平升高，而在GLUT1拮抗剂与SGLT1拮抗剂作用下，HPMCs GLUT1、SGLT1表达中水平降低。

既往研究发现，肺的成纤维细胞中GLUT的表达对肺纤维化有一定影响[15]。本研究发现2.5%葡萄糖腹膜透析液可以促进HPMCs纤维化相关因子TGF-β1、VEGFA、CTGF表达水平升高，而在GLUT1拮抗剂与SGLT1拮抗剂作用下，HPMCs TGF-β1、VEGF-A、CTGF表达水平降低。这表明在下调HPMCs GLUT与SGLT1表达水平后，TGF-β1、VEGF-A、CTGF表达水平也下调。

根皮素主要存在于苹果树的树皮、树叶以及果实中。正如大多数黄酮类化合物一样，研究发现根皮素具有多种药理作用，如抗氧化、免疫抑制、调节糖在体内的转运从而起到降血糖的作用，并在调节细胞增殖、凋亡等细胞周期也有一定的作用，因此可作为GULT1的拮抗剂使用[16]。根皮苷具有降低血糖、改善记忆力、抗氧化、抗癌等多种重要的生物活性，在新型药物和天然保健食品开发中具有广泛的应用前景，同时也是SGLT1的一种拮抗剂[17]。本研究结果显示，根皮素和根皮苷均可下调HPMCs中 GLUT、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的表达水平。

综上所述，本研究通过体外实验观察高糖腹膜透析液对HPMCs GLUT、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF表达的影响，发现2.5%葡萄糖腹膜透析液可以上调HPMCs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的表达水平；而在根皮素与根皮苷作用下，HPMCs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的表达水平均下降。然而GLUT1、SGLT1对HPMCs的具体调控机制较为复杂，还有待更进一步深入研究。

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Expression of GLUT1,SGLT1,TGFβ-1,VEGF-A,CTGF in human peritoneal microvascular endothelial cells cultured with high

glucose peritoneal dialysis fluid

NIE Zhenyu,HONG Mengqi,BAO Beiyan,et al.Department of Nephrology,Ningbo Vrology and Nephrology Hospital,Ningbo 315192,China

Objective To investigate the effect of high glucose-based peritoneal dialysis fluid(PDF)on the expression of glucose transporters1(GLUT1),Na+/glucose cotransporters1(SGLT1),transforming growth factor-β1(TGF-β1),vascular endothelial growth factor-A(VEGF-A)and connective tissue growth factor(CTGF)in human peritoneal microvascular endothelial cells(HPMECs). Methods The cultured HPMECs were divided into 5 groups:normal group(N),peritoneal dialysis(containing 2.5%glucose)group(P);GLUT1 antagonists group(GN),SGLT1 antagonists group(SN);GLUT1 antagonists+SGLT1 antagonists group(GN+SN).The mRNA and protein expression of GLUT1,SGLT1,TGF-β1,VEGF-A and CTGF in HPMECs were detected by RT-qPCR and Western blotting,respectively. Results There were significant differences in mRNA and protein expression of GLUT1,SGLT1,TGF-β1,VEGF-A and CTGF among 5 groups(P＜0.05).Compared with group N,the mRNA and protein expression of GLUT1,SGLT1,TGF-β1,VEGF-A and CTGF in group P was increased significantly(P＜0.05).Compared with group P,the mRNA and protein expression of GLUT1,SGLT1,TGF-β1,VEGF-A and CTGF in groups GN,SN and GN+SN was decreased significantly(P＜0.05). Conclusion High glucose peritoneal dialysis fluid may up-regulate the expression of GLUT1, SGLT1,which may further induce the up-regulating expression of TGF-β1,VEGF-A and CTGF in human peritoneal microvascular endothelial cells,resulting in the peritoneal fibrosis.

Peritoneal microvascular endothelial cells Glucose transporters1 Na+/glucose cotransporters1 TGF-β1 VEGF-ACTGF

2 0 1 6-1 0-2 0）

（本文编辑：李媚）

10.12056/j.issn.1006- 2785.2017.39.8.2016- 1678

浙江省自然科学基金资助项目（Y13H050021）；宁波市科技计划项目（2015C50001）；宁波市鄞州区科技计划项目（鄞科[2011]69号-26）

3 1 5 1 9 2 宁波市泌尿肾病医院肾内科（聂振禹、包蓓艳、李国富、陈争跃、余雄伟）；宁波大学医学院（洪梦琪）

包蓓艳，E- m ail：baobeiyan2007@ sina.com