寺河水样微生物代谢类型研究

元雪芳，刘 健，牛江露

(1.易安蓝焰煤与煤层气共采技术有限责任公司，山西 晋城 048000；2.煤与煤层气共采国家重点实验室，山西 晋城 048000)

·问题探讨·

寺河水样微生物代谢类型研究

元雪芳1,2，刘 健1,2，牛江露1,2

(1.易安蓝焰煤与煤层气共采技术有限责任公司，山西 晋城 048000；2.煤与煤层气共采国家重点实验室，山西 晋城 048000)

在实验室条件下，通过对寺河地区煤层水中微生物古菌的高通量测序分析，发现水样中存在可以产气的产甲烷古菌，以水样作为研究对象，分别添加H2和CO2、乙酸钠、甲醇作为外源碳源，研究寺河地区煤层水中的产甲烷菌哪种途径产气效果最好。结果显示：沁水盆地煤层水中的产甲烷古菌通过3种代谢途径都可以产气，其中以甲基营养型产气最好，氢营养型次之，乙酸营养型产气效果较差。

煤层水；高通量测序分析；产甲烷菌；代谢途径；甲烷菌类型

煤层生物气的生成需要煤层满足埋藏浅、高渗透性和高含水性等条件[1]. 有研究表明，沁水盆地有生物气存在的可能性。煤层中可以形成次生生物气，形成次生生物气的具体途径主要是微生物还原CO2，煤层中的可溶有机质、CO2、H2、气态重烃及水都可以成为微生物利用并最终形成次生生物气的碳源和氢源物质[2-4]. Gupta等认为矿井水中的微生物群落更适合用于煤的生物降解，并分析了矿井水中微生物的群落[5]. 林海课题组从厌氧污泥中富集了产甲烷菌群并以煤为碳源对其进行了驯化,证实该菌群可以利用乙酸盐和甲醇产甲烷,也可以利用煤产生甲烷[6]. 国内致力于煤层本源菌的研究，而国外对外源菌的研究较多。

产甲烷是产甲烷菌获得能量的唯一途径，同时产甲烷菌是唯一以甲烷作为代谢终产物的微生物类群，产甲烷古菌利用的底物种类非常有限，根据底物利用特征主要可以分为3种代谢类型:氢营养型产甲烷菌、甲基营养型产甲烷菌和乙酸营养型产甲烷菌[7-10].

本文通过对寺河地区煤层水样中的古菌多样性进行分析后，加入H2和CO2、乙酸钠、甲醇作为碳源底物，探索寺河水样中的微生物的代谢类型。

1 试 验

1.1 材 料

1.1.1 菌 群

试验所用菌群取自寺河矿区煤层气井出水口，在氮气环境的保护下，迅速用灭菌的密封罐对准出水口接取，并对罐口充氮气密封，送回实验室备用。送回实验室的水样要在荧光显微镜下观察，用420 nm紫外波长进行照射，看是否发蓝绿荧光，确保有产甲烷菌群的存在。

1.1.2 煤 样

试验用煤采自沁水盆地寺河矿区主采煤层，将煤样敲碎，放入球磨机中研磨两分钟，过筛，去20～40目煤粒放入厌氧箱中备用。

1.1.3 主要仪器

HIRAYAMA HVE-50灭菌锅，安捷伦7890A气相色谱，500 mL的厌氧瓶，DWS厌氧操作箱，LRH-500F恒温培养箱。

1.1.4 培养基成分

NH4Cl 0.2 g/L KH2PO40.2 g/L K2HPO40.2 g/L MgCl20.2 g/L YE 1 g/L每升中加入1 mL的刃天青作为氧化还原的指示剂；121 ℃灭菌20 min，灭菌后放入厌氧箱中除氧备用。

1.2 水样中古菌的高通量测序

实验中为了保证基因组DNA提取效果，采用OMEGA水样DNA提取试剂盒，收集的水样菌体进行DNA提取，提取方法严格按照说明书操作方法进行。提取的基因组用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，确认DNA无污染、无降解。然后用特异性引物扩增V6-F(5’-CAACGCGARGAACCTTACC-3’)和V6-R(5’-CGACAGCCATGCANCACCT-3’)进行PCR扩增，利用OLIGO软件预测PCR扩增条件，扩增古菌16SrdnaV6区片段PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，确定条带大小并无杂带，送深圳华大科技公司进行ILLUMINA双末端测序分析。

1.3 实验设计

选取100 mL的血清瓶，设置3组实验，每组实验两个平行样。每个厌血清瓶中加入50 mL培养基、20 mL的煤层水样和5 g的20～40目的煤粒，SHB1组中另外加入1 mL的甲醇作为碳源底物；SHB2中加入乙酸钠2.5 g；SHB3中添入50 mL的4∶1的H2和CO2的混合气体。血清瓶用橡胶塞和铝盖密封，所有操作均在厌氧箱中进行。

1.4 甲烷气体组分测定

甲烷气体含量的测定采用安捷伦7890A气相色谱仪，色谱柱为Agilent Carbonplot(60 m×320 μm),载气为高纯氮气，填充柱进样口温度150 ℃，隔垫吹扫流量3 mL/min,进样量500 μL,柱箱温度25 ℃，保持7.5 min，检测器为TCD. 检测温度200 ℃，参比流量400 mL/min,尾流量8 mL/min.

甲烷含量=甲烷实际出峰面积×(标气中甲烷浓度/标气中甲烷平均峰面积)

2 结果与讨论

2.1 古菌V6高变区测序结果分析

实验室中提取的DNA经琼脂糖检测条带大小在23 kb左右，用16SrdnaV6区特异性引物进行扩增，pcr产物图见图1，水样中微生物扩增条带清晰明显，与Maker比对大小在100 bp左右，无污染。

图1 PCR扩增产物凝胶电泳图

将测序所得的序列在GENEBANK数据库中比对结果如下：水样中的古菌类群都属于广古菌门，包含了甲烷微球菌纲和甲烷杆菌纲。其中，甲烷微球菌纲又分为甲烷微菌目、甲烷八叠球菌目；甲烷杆菌纲分为甲烷杆菌目，细分为甲烷鬃菌科和甲烷杆菌科，到属的水平划分为甲烷烁菌属、甲烷丝状菌属和甲烷细菌属。其中甲烷细菌属为氢营养和甲基营养型都可以的代谢途径；甲烷烁菌属为氢营养型，甲烷丝状菌属为乙酸营养型产甲烷途径。水样中甲烷古菌的类型图见图2.

图2 水样中甲烷古菌的类型图

氢营养型产甲烷古菌利用H2、甲酸盐等电子供体还原CO2产生CH4；有的氢营养型产甲烷古菌可以利用二元醇、丙酮酸盐作为电子供体进行产甲烷。甲基营养型产甲烷古菌能利用甲基类化合物(如甲醇)、甲胺类化合物(如甲胺、二甲胺、三甲胺)和甲基硫化合物(如甲硫醇、二甲基硫)进行产CH4生长；乙酸营养型产甲烷古菌只利用乙酸产生CH4和CO2. 具体的代谢反应见表1.

表1 不同类型营养型古菌的代谢反应表

2.2 底物类型对微生物产气含量分析

每组样品中气体主要是由CH4和CO2组成，样

品中各气体的组分含量及变化趋势见图3. SHB1组的甲烷含量最高为30.88%，SHB2组的甲烷含量最高为4.2%，SHB3组的甲烷含量最高为13.76%. 其中，随着甲烷含量的升高，SHB2组的CO2呈现先升高再下降的趋势，其余两组的CO2含量都是逐步降低的趋势。加入甲醇的SHB1组，微生物的活性在第21～28天出现了一个倍数的增长，到28天后到达一个生长缓慢的平稳期。这是因为产甲烷菌利用甲醇合成自身的细胞物质，使其数量有效的增长直接导致气体组分中CH4含量的显著增加。

图3 样品中CH4和CO2相对含量的变化特征曲线图

甲醇、乙酸钠、混合气的添加均增加了系统中CH4的含量，乙酸钠溶解在水中形成CHCOO-可直接被产甲烷菌利用，产生CH4和CO2，而CO2的生成会降低菌液的PH值，这可能是加入乙酸钠对产甲烷激活作用不明显的原因。混合气的加入直接激活了水样中氢营养型甲烷菌的活性，但是系统中H2和CO2的比例又是限制氢营养型产甲烷菌活性的重要因素。

寺河水样中微生物以甲醇、乙酸钠和混合气为底物的3种代谢活动类型都能产气，其中以甲基型产气类型较好，乙基型产气类型较差。

由水样高通量测序发现甲烷丝状菌属产甲烷菌群较多，它主要以乙酸途径为主，但是由实验结果发现甲基产甲烷效果最好，其中可能存在的原因有：1) 以甲醇为底物的产气途径，微生物能较快的利用甲醇产甲烷，加入混合气的产甲烷途径，虽然是按1∶4的比例进行了添加，但是不能确保添加进入的气体的比例，而添加乙酸钠的产气途径中，乙酸钠的水解速率可能限制了甲烷产生的速率。2) 甲烷丝状菌属又归为甲烷八叠球菌目中，其中甲烷八叠球菌目中有甲基产甲烷八叠球菌，因此加入甲酸钠和甲醇的产气含量高不排除激活了甲烷八叠球菌目中的某一类群甲烷菌。

3 结 论

寺河水样中微生物的类群主要以广古菌门、甲烷八叠球菌目为主，其中的古菌类群主要有甲烷丝状菌属、甲烷烁菌属和甲烷细菌属。以水样作为菌源，甲醇、乙酸钠、混合气作为底物的产气实验表明，3种底物类型均可以激活寺河水样中的微生物产甲烷，其中以加入甲醇的产甲烷类型最好，加入混合气的代谢途径次之，以乙酸钠为底物的代谢途径较差。但是系统中具体是哪种菌在起作用还需进一步的研究。

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Study on Microbial Metabolic Types of Water in Sihe Coal Mine

YUAN Xuefang, LIU Jian, NIU Jianglu

Under the laboratory conditions, by the high-flux sequencing analysis of microbial archaea in coal seam water, it is found that there are methanogenic bacteria in the water sample, and the water samples are used as the research object, CO2, H, sodium acetate and methanol being the exogenous carbon sources, to seek for the best way for methane production in coal seam water. The results show that the methanogenic bacteria gas in coal seam water in Qinshui basin can be produced by all the three pathways, among which methyl is the best, the hydrogen good and the acetic acid nutrition poor.

Coal seam water; High-flux sequencing analysis; Methanogens; Metabolic pathways; Methane bacteria type

2016-12-18

山西省煤炭煤基重点科技攻关项目—煤地质微生物成气机理研究(MQ2014-03)

元雪芳(1986—)，女，山西晋城人，2009年毕业于山西农业大学，助理工程师，主要从事煤炭生物气化试验工作

(E-mail)1325771086@qq.com

TD712

B

1672-0652(2017)02-0050-03