超声波辅助酶法提取榛蘑多糖

陈 超,岳崇慧,王艳菲,藏小丹,刘 鹏,于国萍

(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

超声波辅助酶法提取榛蘑多糖

陈 超,岳崇慧,王艳菲,藏小丹,刘 鹏,于国萍*

(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

目的:为了研究榛蘑中多糖的提取条件,以榛蘑多糖得率为指标,采用超声波辅助复合酶(纤维素酶、木瓜蛋白酶)法进行实验。方法:通过单因素实验研究了酶解温度、超声功率、超声时间、液料比、酶解时间、复合酶比例以及加酶量对榛蘑多糖得率的影响,在此基础上进行响应面优化实验。结果:通过单因素实验,确定了酶解温度50 ℃、超声功率360 W、超声时间20 min;通过响应面优化实验,确定了最佳提取条件:加酶量1.9%、复合酶比例2∶1、酶解时间138 min、液料比30∶1(mL/g)。结论:在此条件下,榛蘑多糖得率为40.56%。

榛蘑,多糖,超声波,纤维素酶,木瓜蛋白酶

榛蘑又名蜜环菌,隶属于真菌界,是口蘑科真菌蜜环菌的子实体,普遍存在于温带地区。榛蘑口感鲜美,富含丰富的营养物质,如蛋白质、碳水化合物、维生素、以及锌、铁、镁等矿物质,因此可以开发具有功能性的榛蘑食品[1]。

榛蘑多糖作为一种活性多糖,具有促进造血、免疫调节、抑制肿瘤生长等药理作用[2]。近年来,药用真菌多糖因其具有降血脂、抗感染等功能,逐渐引起了人们的关注。关于榛蘑多糖的研究早已有所报道,余晨晨等[3]利用红外光谱、气相衍生化分析榛蘑水溶性多糖的结构,实验结果表明,榛蘑多糖结构由吡喃葡萄糖组成;也有研究发现[4],榛蘑子实体胞内多糖由D-葡萄糖和D-半乳糖组成,气相色谱分析结果显示,二者比例为5∶1。榛蘑多糖的提取方法有很多[5],如采用热水、稀酸、稀碱作为浸提剂,但这些方法操作时间长、效率低,多糖提取率普遍不高。而超声波法提取多糖,是利用超声波产生的振动破坏细胞壁,使溶剂渗透到细胞中,能使物质中分子加速运动,从而提高提取率[6];酶可以水解纤维素、糖蛋白,以及酶具有高效性和专一性,使得在提取过程中能够节约时间、产物稳定[7]。

本实验采用超声波辅助酶法提取榛蘑多糖,具有提取时间短、效率高等特点,优化榛蘑多糖的提取工艺,对榛蘑多糖的工业化生产具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

榛蘑 产自黑龙江省尚志市珍珠山乡,清水洗净后放入干燥器进行干燥,之后用粉碎机粉碎,过60目筛,备用;葡萄糖、苯酚、浓硫酸等 均为分析纯;纤维素酶 315000 U/g,上海蓝季技术发展有限公司;木瓜蛋白酶 490200 U/g,北京奥博星生物技术有限责任公司。

表1 响应面因素与水平Table 1 Factors and levels in response surface design

DZW电热恒温水浴锅 天津莱斯特仪器有限公司;PHSJ-3F实验室pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;H-1微型漩涡混合器 上海精科实业有限公司;AL-104型精密电子天平 上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司;TU-1800紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;小型台式高速离心机 上海安亭科学仪器厂;FW型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 榛蘑多糖提取得率测定

1.2.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制 分别向8支试管中吸取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的100 μg/mL的葡萄糖溶液,用蒸馏水将每支试管补至2.0 mL。随后向每支试管中分别加入1.0 mL浓度为6%的苯酚,迅速滴加浓硫酸5.0 mL,振荡均匀后于沸水浴中煮沸20 min,冷却5 min,并在490 nm处测定吸光度[8]。以葡萄糖浓度为横坐标x,吸光度为纵坐标y,绘制葡萄糖标准曲线得y=0.007x-0.006,R2=0.999。

1.2.1.2 多糖提取得率的计算 移取2.0 mL多糖提取液,按照与制作标准曲线相同的方法测定吸光度,以2.0 mL蒸馏水按相同操作作为空白实验。

榛蘑多糖得率(%)=多糖浓度(g/mL)×稀释倍数×提取液体积(mL)/原料质量(g)×100

1.2.2 超声波辅助酶法提取榛蘑多糖的工艺 称取粒径为60目的榛蘑样品5 g,首先按照不同的条件在水溶液中酶解。随后100 ℃沸水中灭酶10 min,冷却至室温。接着上述体系再经过不同条件的超声处理后,于4000 r/min离心30 min,所得到的上清液即为榛蘑多糖提取液。将上清液稀释适当倍数后,依照葡萄糖标准曲线的制作方法,在490 nm波长处测定吸光度值。

1.2.3 超声波辅助酶法提取榛蘑多糖的单因素实验 研究液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)、酶解时间(80、100、120、140、160 min)、酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)、加酶量(占底物的百分比，1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%)、复合酶比例(纤维素酶∶木瓜蛋白酶为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)、超声功率(240、280、320、360、400 W)和超声时间(10、15、20、25、30 min)7个因素对多糖得率的影响。其中,固定值为:液料比20∶1、酶解时间2 h、酶解温度45 ℃、加酶量(占底物百分比)1%、复合酶比例为1∶1、超声功率320 W、超声时间20 min。

1.2.4 响应面法对榛蘑多糖提取条件进行优化 在单因素实验的基础上,根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理,采用响应面法在四因素三水平上对多糖提取条件进行优化。如表1所示。

1.3 数据处理

数据使用统计分析软件Design-Expert.V8.0.6.1进行实验设计和数据分析;使用SPSS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助酶法提取榛蘑多糖的条件确定

2.1.1 液料比对多糖得率的影响 如图1所示,多糖得率会随着液料比的增加而增大,这是由于液料比的增加,使得更多的水分子渗透到物料中,从而增大了多糖与水分子的接触面积[9],利于多糖的提取;当液料比超过20∶1时,随着体系中水分的增加使酶浓度降低,酶与底物结合不充分,就出现了提取得率下降的趋势[10];而且液料比过高不利于后期的分离浓缩,因此选择20∶1作为多糖的最佳液料比。

图1 液料比对多糖得率的影响Fig.1 The effect of liquid material ratio on the rate of polysaccharide extraction注:不同字母代表差异显著(p<0.05),图2～图7同。

2.1.2 酶解时间对多糖得率的影响 如图2所示,多糖提取得率会随着酶解时间的增加而增大,这是由于酶解时间过短,多糖在水溶液中溶解不彻底;当酶解时间140 min时,溶剂的渗透与多糖向周围溶剂的扩散达到平衡,此时多糖得率达到最大值;当超过140 min时,提取得率有下降趋势,可能的原因是提取时间过长会引起多糖水解[10]。因此选择140 min作为提取的最佳酶解时间。

图2 酶解时间对多糖得率的影响Fig.2 The effect of enzymolysis time on the rate of polysaccharide extraction

2.1.3 酶解温度对多糖得率的影响 本实验选用的复合酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶,其中纤维素酶的最适温度范围是40～60 ℃,而木瓜蛋白酶的最适温度范围是50～65 ℃[8]。如图3所示,多糖得率会随着酶解温度的升高而增大;当温度超过50 ℃,多糖得率会显著下降,是由于温度的升高导致酶活性降低或使部分酶失活[7]。而50 ℃是两种酶都适合的反应温度,因此选择50 ℃作为提取多糖的最佳酶解温度。

图3 酶解温度对多糖得率的影响Fig.3 The effect of enzymolysis temperature on the rate of polysaccharide extraction

2.1.4 加酶量对多糖得率的影响 如图4所示,多糖得率会随着加酶量的增加而增大,当加酶量超过1.75%时,多糖得率下降,其原因可能是当酶浓度达到一定程度时,酶分子处于过度饱和状态,导致一部分酶无法与底物结合,使提取得率降低[11]。因此选择1.75%作为提取多糖的最佳加酶量。

图4 加酶量对多糖得率的影响Fig.4 The effect of enzyme concentration on the rate of polysaccharide extraction

2.1.5 复合酶比例对多糖得率的影响 如图5所示,当复合酶比例从3∶1变为2∶1时,多糖得率增大,其原因可能是:这两种酶在此比例时,对蛋白、纤维素两类物质的分解达到最大值,在分解细胞结构的同时有利于多糖的浸出;当复合酶的比例从2∶1逐渐变为1∶3时,两种酶的比例与相应底物的比例不符,分解的量少,多糖得率降低;此外,当复合酶中木瓜蛋白酶的比例增大时,可能是由于木瓜蛋白酶在分解蛋白类物质的同时,产生的小分子物质对多糖有一定的包埋作用[7],从而影响多糖的提取。所以只有在复合酶比例为2∶1时,这两种酶都能充分发挥作用。因此选择2∶1作为提取多糖的最佳复合酶比例。

图5 加酶比例对多糖得率的影响Fig.5 The effect of ratio of compound enzyme on the rate of polysaccharide extraction

2.1.6 超声功率对多糖得率的影响 如图6所示,得率会随着超声功率的增加而增大,其原因可能是超声功率增大,超声的空化作用和搅拌作用增强,超声的空化作用会破坏溶质的细胞壁,使得溶剂更易进入细胞中,从而使多糖得率增大;然而若超声功率超过360 W,超声波的剧烈作用会对多糖产生破坏作用从而降低得率[12]。因此选择360 W作为提取多糖的最佳超声功率。

图6 超声功率对多糖得率的影响Fig.6 The effect of ultrasonic power on the rate of polysaccharide extraction

图7 超声时间对多糖得率的影响Fig.7 The effect of ultrasonic time on the rate of polysaccharide extraction

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Rseponse surface design arrangement and experimental results

表3 回归模型方差分析Table 3 Regression model variance analysis

注:**:影响极显著(p<0.01);*:影响显著(p<0.05)。

2.1.7 超声时间对多糖得率的影响 如图7所示,多糖得率会随着超声时间的增加而增大;当超声时间超过20 min,多糖得率反而下降。其原因可能是超声时间的增加使得提取溶剂有充足的时间和榛蘑粉末作用,有利于多糖的溶出;若超声时间过长,温度和超声波会对已经提取出的多糖产生破坏作用,降低得率[13]。因此选择20 min作为提取多糖的最佳超声时间。

2.2 响应面优化实验结果

2.2.1 模型的建立及显著性的检验 采用响应面分析法分析实验结果,结果见表2,得到以榛蘑多糖得率为响应值的回归方程:

Y=40.81+3.75A+3.05B-0.12C-0.30D-2.61AB-2.24AC-0.96AD-0.90BC+4.52BD+2.39CD-4.37A2-6.92B2-5.17C2-5.76D2。

为了检验回归方程的有效性及各因素对榛蘑多糖得率的影响程度,对回归方程进行方差分析,结果见表3。从表3可以看出,回归模型中,p<0.0001,表明得到的回归方程拟合程度较好,回归效果极显著;而失拟项p=0.5142>0.05,说明失拟项不显著。因此,应用此方程来模拟指标值与因素的关系是可行的。同时,其方程的相关系数R2=0.9767,表明97.67%的数据可以用此方程解释。

由表3还可知,加酶量A和复合酶比例B的p<0.01,说明对多糖得率影响差异极显著,酶解时间C和液料比D的p>0.05,说明对多糖得率影响差异不显著;四个因素的二次项对榛蘑多糖得率的影响均达到差异极显著水平;而交互项AB、AC、BD、CD对多糖得率的影响差异极显著,AD、BC对多糖得率的影响差异不显著。

2.2.2 响应面交互作用的分析与优化 通过Design-Expert软件绘制响应面曲线图,目的是进一步研究各因素之间的交互作用。图8～图13分别显示了6组以榛蘑多糖得率为响应值的趋势图。

图8 加酶量和复合酶比例对多糖得率的响应面Fig.8 Curved surface of response of enzyme concentration and ratio of compound enzyme to the rate of polysaccharide extraction

图9 加酶量和酶解时间对多糖得率的响应面Fig.9 Curved surface of response of enzyme concentration and enzymolysis time to the rate of polysaccharide extraction

从图8可知,加酶量和复合酶比例的交互作用对多糖得率的影响较大。随着加酶量和复合酶比例的增加,多糖得率均呈现先升高后下降趋势。这主要是由于,当反应体系中酶浓度增大时,酶与底物的接触机会增加,多糖溶出加快;反之,由于溶液中的酶分子已经饱和,多余酶分子无法与底物结合,底物水解的速度就会减慢,使得多糖得率下降[5],因此只有在适宜的加酶量和复合酶比例条件下,多糖得率才能达到最大值。

同样,从图9～图13中可以看出,加酶量和酶解时间、复合酶比例和液料比、酶解时间和液料比的交互作用，对多糖得率影响极显著。只有加酶量和酶解时间、加酶量和液料比、复合酶比例和酶解时间、复合酶比例和液料比、酶解时间和液料比的比例适合，多糖得率才能达到最大值。

图10 加酶量和液料比对多糖得率的响应面Fig.10 Curved surface of response of enzyme concentration and liquid material ratio to the rate of polysaccharide extraction

图11 酶解时间和复合酶比例对多糖得率的响应面Fig.11 Curved surface of response of enzymolysis time and ratio of compound enzyme to the rate of polysaccharide extraction

图12 液料比和复合酶比例对多糖得率的响应面Fig.12 Curved surface of response of liquid material ratio and ratio of compound enzyme to the rate of polysaccharide extraction

由各响应面可以看出,响应值存在最大值。通过软件分析计算得出多糖的理论最佳提取工艺:加酶量1.86%、复合酶比例2.14∶1、酶解时间137.55 min、液料比29.69∶1 mL/g,在此条件下,多糖得率为41.83%。为了验证该模型的准确性,采用修正的最佳提取条件:加酶量1.9%、复合酶比例2∶1、酶解时间138 min、液料比30∶1 mL/g,对多糖得率进行验证性实验,平行实验3次,多糖得率的平均值为40.56%,与理论预测值(41.83%)的相对标准偏差RSD为1.08%,说明该回归模型准确可靠。由于榛蘑多糖的提取工艺不同,得到的多糖得率也不尽相同。邹东恢[5]、邵信儒[1]分别采用多酶法和热水浸提法从榛蘑中提取多糖,得率分别为16.85%和4.81%。相比之下,本实验采用的超声波辅助复合酶法得到的多糖得率更高,对榛蘑多糖的工业化生产具有重要意义。

3 结论

在超声波辅助酶法提取榛蘑多糖的实验中,通过单因素实验确定酶解温度50 ℃、超声波功率360 W、超声波时间20 min;在此基础上,通过响应面优化实验得到最佳工艺条件为:加酶量1.9%、复合酶比例2∶1、

图13 酶解时间和液料比对多糖得率的响应面Fig.13 Curved surface of response of enzymolysis time and liquid material ratio to the rate of polysaccharide extraction

酶解时间138 min、液料比30∶1(mL/g),此条件下得到的最佳提取得率为40.56%,与理论预测值基本相符,因此可以用该模型分析响应值的变化。

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Ultrasonic-assisted enzymatic method extraction of polysaccharide fromArmillariamellea

CHEN Chao,YUE Chong-hui,WANG Yan-fei,ZANG Xiao-dan,LIU Peng,YU Guo-ping*

(College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Objective:In order to study the extraction technology of polysaccharide fromArmillariamellea,based on the polysaccharide yield,polysaccharide was extracted by ultrasonic-assisted enzymatic(cellulase,papain)method. Method:This paper studied the optimal extraction conditions by single factor experiment,such as enzymolysis temperature,ultrasonic power,ultrasonic time,liquid material ratio,enzymolysis time,ratio of compound enzyme,enzyme concentration. The optimal conditions were obtained by response surface methodology on the basis of single factor experiment. Result:By single factor experiment,enzymolysis temperature 50 ℃,ultrasonic power 360 W,ultrasonic time 20 min were determined.The results of response surface methodology showed that the optimal extraction conditions were enzyme concentration 1.9%,ratio of compound enzyme 2∶1,enzymolysis time 138 min,liquid material ratio 30∶1(mL/g). Conclusion:Under the optimal extraction conditions,the yield of polysaccharide reached 40.56%.

Armillariamellea;polysaccharide;ultrasonic;cellulase;papain

2016-10-11

陈超(1993-),女,硕士研究生,研究方向:粮食、油脂及植物蛋白工程,E-mail:18846921675@163.com。

*通讯作者:于国萍(1963-),女,博士,教授,研究方向:粮食、油脂及植物蛋白工程,E-mail:yuguopingneau@hotmail.com。

TS255.1

A

1002-0306(2017)08-0222-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.035