酶法改善卵白蛋白乳化性研究

许美玉,王希希,黄 群,林 超,宋洪波,王艺伟,滕 慧

(福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002)

酶法改善卵白蛋白乳化性研究

许美玉,王希希,黄 群*,林 超,宋洪波,王艺伟,滕 慧

(福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002)

采用碱性蛋白酶通过酶法改性以改善卵白蛋白乳化性。在单因素实验的基础上,以乳化活性为响应值,选取酶解时间、pH、酶解温度为考察因素,根据Box-Behnken中心组合设计原理建立数学模型,进行响应面分析。获得卵白蛋白乳化性的酶法改性最佳工艺为:底物浓度1.0%、酶用量30000 U/g、酶解时间195 min、pH9.0、酶解温度38 ℃。在此条件下改性卵白蛋白乳化活性为0.967±0.031,乳化活性相比未改性提高89.61%,说明碱性蛋白酶改性改善卵白蛋白乳化性效果理想。

卵白蛋白,碱性蛋白酶,酶法改性,乳化活性,乳化稳定性

我国是世界上禽蛋产量最高的国家,由于其特有的生理特性导致无法长时间贮藏,且由于历史和民族背景,我国国内对于蛋品的深加工研究还是处于初级研究阶段。国外对于蛋品深加工产品(如全蛋液、蛋黄液、蛋白液等)接受程度较高,且对蛋品研究较为系统、透彻。我国对蛋清蛋白的研究集中在卵白蛋白起泡性上,对于卵白蛋白乳化性的研究报道很少。卵白蛋白是典型的球蛋白,等电点为4.5,由385个氨基酸残基组成,疏水性氨基酸占50%以上,含有埋藏于疏水核心内部的自由巯基[1],卵白蛋白的巯基在蛋白质变性过程当中起很大作用。由于卵白蛋白具有良好的凝胶和泡沫特性,是食品加工的重要原辅料,但欠理想的乳化性限制其在乳化体系中的应用。目前,改善蛋白功能特性的方法有:化学法,如牛新培[2]等采用不同体积分数乙醇溶液,对大豆7S球蛋白进行变性研究;物理法,如黄群[3]等采用超高压处理对卵白蛋白处理后,研究卵白蛋白构想与功能特性;酶法,如涂勇刚[4]等利用木瓜蛋白酶改善蛋清蛋白起泡性,并用响应面优化工艺参数。针对酶法改性改善乳化性的酶类分别有植物蛋白酶、动物蛋白酶、微生物蛋白酶和其它酶类[5]。本文使用的酶类为微生物蛋白酶类,从提高乳化活性着手,采用碱性蛋白酶适度降解卵白蛋白,减小水-油界面张力使得乳化液更为稳定。同时微生物蛋白酶具有适用范围广、经济、方便、易制得等特点,是蛋白酶法改性研究的重点关注对象。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡蛋 市售；碱性蛋白酶(2000000 U/g) 北京奥博星生物技术有限责任公司;金龙鱼食用调和油 购于嘉里粮油中国有限公司;硫酸铵、氢氧化钠、浓盐酸等 均为分析纯。

722型可见分光光度计 上海舜宇恒平科学科学仪器有限公司;FJ200-SH数显高速分散均质器 上海标本模型厂;HJ-3数显恒温磁力搅拌器 常州振华仪器有限公司;FD5-2.5真空冷冻干燥器 美国SIM公司;DM2000显微镜及DFC280摄像系统 德国徕卡公司。

1.2 实验方法

1.2.1 卵白蛋白提取 提取卵白蛋白的方法是盐析法[6]。选择无污染、无裂缝、新鲜的鸡蛋,破壳分离蛋白与蛋黄,尽量使蛋白中无蛋黄混入,防止蛋黄中的蛋白质干扰实验。蛋清液与水按体积比2∶1稀释,在25 ℃、磁力搅拌条件下,缓慢加入(NH4)2SO4至饱和度0.65,继续搅拌1～2 h。混合液在4500 r/min的条件下离心20 min,将所得到的沉淀,即为卵白蛋白粗蛋白。透析袋经煮沸处理后,装入粗蛋白,置于蒸馏水中,透析24 h,每2 h换一次水,将透析袋中的溶液真空冷冻干燥后,收集粉末即为卵白蛋白粗品纯品。

1.2.2 酶法改性流程 卵白蛋白→加蒸馏水(配成一定的底物质量浓度)→调节pH→加酶(U/g)→酶解→80 ℃水浴5 min钝化酶→置于冷水中迅速冷却至室温→收集上清液。

1.3 实验设计

1.3.1 单因素实验 以乳化活性与稳定性为评价指标,底物浓度、pH、酶用量、酶解时间、酶解温度为实验考察因素,分别进行单因素实验,探讨各因素变化对卵白蛋白乳化性的影响。

称取蛋白配成不同底物浓度的蛋白溶液,调节pH到7.0,酶用量为30000 U/g,酶解温度为45 ℃,酶解时间为90 min,设置底物浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,探究不同底物浓度对卵白蛋白乳化性的影响。

称取1.0 g蛋白配成底物浓度为1.0%的蛋白溶液,酶用量为30000 U/g,酶解温度为45 ℃,酶解时间为90 min,设置pH分别为 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,探究不同pH对卵白蛋白乳化性的影响。

称取1.0 g蛋白配成底物浓度为1.0%的蛋白溶液,调节pH到7.0,酶解温度为45 ℃,酶解时间为90 min,设置酶用量分别为10000、20000、30000、40000、50000 U/g,探究不同酶用量对卵白蛋白乳化性的影响。

称取1.0 g蛋白配成底物浓度为1.0%的蛋白溶液,调节pH到7.0,酶用量为30000 U/g,酶解时间为90 min,设置酶解温度分别为20、25、30、35、40、45、50 ℃,探究不同酶解温度对卵白蛋白乳化性的影响。

称取1.0 g蛋白配成底物浓度为1.0%的蛋白溶液,调节pH到7.0,酶用量为30000 U/g,酶解温度为45 ℃,设置酶解时间分别为30、60、90、120、150、180、210 min,探究不同酶解时间对卵白蛋白乳化性的影响。

1.3.2 响应面优化实验 在单因素实验基础上,选取酶解时间、pH、酶解温度为影响因子,以卵白蛋白乳化活性为响应值,设计Box-Behnken中心组合实验,进行二次多项回归方程拟合并优化分析得到最佳工艺条件。

表1 响应面法实验因素及水平编码Table 1 Factors and their coded levels in response surface analysis

1.4 卵白蛋白乳化性测定

卵白蛋白溶解于去离子水中,配制成1.0 g/mL的蛋白溶液。经过不同条件下酶法改性后,取3 mL样品加入27 mL去离子水中,加入10 mL食用大豆调和油,在室温下以10000 r/min速度均质1 min以形成乳化液。均质后立即从乳化液底部吸取200 μL,加入10 mL质量分数为0.1% SDS中,充分混匀后,以0.1% SDS溶液作空白,在500 nm处测其吸光度A1,即为乳化活性EA。静置15 min后,再次测定吸光度A2,即得乳化稳定性ES=A1×t/(A1-A2),t表示为静置时间[1]。实验测得未经改性处理的卵白蛋白的乳化活性为0.51。

1.5 乳化液微观结果观察

水解后的酶解液和未水解的蛋白液立即在室温下10000 r/min均质1 min以形成乳化液,从混合液底部吸取1滴乳化液置于载玻片上,盖上盖玻片,在DM2000显微成像系统下进行观察,放大倍数为100。

1.6 数据处理

Box-Behnken响应面实验的设计与结果分析采用Design-Expert 8.0.5.0软件。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

图1 底物浓度对卵白蛋白乳化性的影响Fig.1 Effect of substrate concentration on emulsifying property of ovalbumin

2.1.1 底物浓度的影响 由图1分析可知,随着底物浓度增加,卵白蛋白乳化活性缓慢下降;在底物浓度(W/V)为1.5%时,下降到最低值,随后迅速上升。而乳化稳定性变化趋势恰好相反,随底物浓度的逐渐增加而上升,当底物浓度(W/V)为1.5%时,卵白蛋白乳化稳定性达最大值;此后底物浓度继续增加时,乳化稳定性开始急剧下降。乳化液的稳定性是由水油之间的界面张力大小决定的,随着底物浓度的升高,酶与卵白蛋白接触机会增加而导致酶解作用增强,卵白蛋白中更多疏水基朝向油相,更多亲水基朝向水相,减小水和油之间的界面压力,使得水油界面不易涨破,从而乳化液更趋于稳定[7]。但是底物浓度过大时,酶解热处理过程中小分子聚合形成可溶性的聚合多肽,会增加界面张力而使得乳化稳定性逐渐减小[8]。综合考虑乳化活性与稳定性,底物浓度以1.0%为佳。

2.1.2 pH的影响 由图2分析可知,卵白蛋白乳化活性在pH6.0～9.0的范围内呈逐步下降的趋势,在pH10.0时迅速上升。而乳化稳定性随pH的增加,呈现出先增加后减少的趋势,在pH为9.0时达到最大值。这可能是酶有适宜的pH范围,碱性蛋白酶最适条件为7.0～9.0;当溶液pH超过这一范围时,在酸、碱的作用下,酶变性失活聚集沉淀,影响其乳化性。随着pH的增加,蛋白质分子所带净电荷增加,导致分子间排斥力增加,分子分散性增强、溶解性更好[9],可以与碱性蛋白酶更好地接触,提高酶解效果。同时在偏酸的条件下,卵白蛋白可能因过于接近等电点而析出,或者过碱的条件下也可能导致卵白蛋白变性聚合沉淀。因此,综合考虑乳化活性与稳定性,pH以7.0～9.0为宜。

图2 pH对卵白蛋白乳化性的影响Fig.2 Effect of pH value on emulsifying property of ovalbumin

2.1.3 酶用量的影响 由图3分析可知,卵白蛋白乳化活性随着酶用量的增加先快速下降而后缓慢增加;乳化稳定性首先随酶质量分数的增大而提高,酶用量为30000 U/g时达到最大值,然后随着酶用量的增加反而降低。这可能是随着碱性蛋白酶用量的增加,使得蛋白酶与卵白蛋白质分子肽链的接触机率增加,随着肽链水解程度的增加,卵白蛋白分子刚性降低,球形分子数目减少,线性分子数目增大,提高了蛋白质的分子柔性,使蛋白质分子在油-水界面上的有序排列更多,乳化能力增强[10],由此构成的蛋白质薄膜具有较好的抗应变能力和黏弹特性,乳化稳定性进一步提高。但当酶用量达到一定程度后,酶解程度过高,卵白蛋白浓度不能满足酶解。因此,综合考虑乳化活性与稳定性,酶用量以30000 U/g为佳。

图3 碱性蛋白酶用量对卵白蛋白乳化性的影响Fig.3 Effect of Alcalase quantity on emulsifying property of ovalbumin

2.1.4 酶解温度的影响 由图4可知,随着酶解温度的升高,乳化活性逐渐增大,30 ℃时卵白蛋白的乳化活性达到最大值;但随着温度的继续升高,乳化活性又逐渐减小。卵白蛋白乳化稳定性在20～35 ℃之间变化不显著,而在35～45 ℃的区间范围内增加速率较快,45 ℃后出现下降趋势。导致该现象的发生可能是酶均有各自的最适作用温度,低温或高温均能抑制酶活性。同时在较低温度下蛋白质溶解度不够,从而使得碱性蛋白酶无法充分对其进行水解;在较高的温度下酶解后的小分子肽因不断受热聚合沉集。因此,综合考虑乳化活性与稳定性,酶解温度以35～45 ℃为宜。

图4 酶解温度对卵白蛋白乳化性的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on emulsifying property of ovalbumin

图5 酶解时间对卵白蛋白乳化性的影响Fig.5 Effect of hydrolysis time on emulsifying property of ovalbumin

2.1.5 酶解时间的影响 由图5分析可知,卵白蛋白乳化活性随酶解时间的延长而下降,在120 min后下降趋势逐渐趋于平缓。酶解时间对乳化稳定性的影响呈现先增加后减小的趋势,在180 min处达到最大值。这可能是水解后蛋白质的平均分子质量减小,表面疏水性增加,溶液粘度下降,降低水-油界面的张力,使得酶法改性后的卵白蛋白与油脂结合更为紧密。当改性时间延长,底物浓度减少,导致更多的疏水基曝露,有利于形成粘弹性好而稳定的膜[11],乳化稳定性得到改善。因此,综合考虑乳化活性与稳定性,酶解时间以150～210 min为宜。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of the created regression response surface model for emulsifying activity

注:**表示极显著(p<0.01),*表示显著(0.01

2.2 响应面优化卵白蛋白乳化活性

2.2.1 Box-Behnken实验设计方案及实验 鉴于单因素实验中乳化稳定性呈现较理想的改善效果,在优化实验中选择乳化活性为响应值,确定自变量酶解时间、pH、酶解温度的实验水平,采用Box-Behnken 实验设计方法,研究各自变量及其交互作用对卵白蛋白乳化活性的影响[12-13]。使用Design Expert 8.0.5.0软件设计3因素3水平共17组实验,实验3、4、5、12、13为中心实验,其他为析因实验。17个实验点分为零点和析因点,零点为区域的中心点,其中析因点为自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点,零点实验重复5次,用以估计实验误差。Box-Behnken实验设计方案及结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding results for response surface analysis

2.2.2 响应面优化实验结果 利用Design-Expert 8.0.5.0程序对所得数据进行ANOVA分析,分析结果见表3。

2.2.3 响应面分析与优化 在方差分析的基础上,利用Design-Expert 8.0.5.0软件绘制交互显著项AB、AC、BC的交互作用曲面图和等高线图,图7～图9直观地给出了三个影响因子交互作用的响应面的3D和等高图。从响应面的最高点和等值线可以看出,在所选的范围内存在极值,即是等值线最小椭圆的中心点,同时也是响应曲面上的最高点。由Design-Expert8.0.5分析得到最大响应值(Y)时,其最大乳化活性的最佳工艺条件为酶解时间195 min,pH9.0,酶解温度38 ℃,理论最大乳化活性为0.956。

图7 Y=f(A,B)的响应面和等高线分析图Fig.7 Response surface and contour plot of Y=f(A,B)

图8 Y=f(A,C)的响应面和等高线分析图Fig.8 Response surface and contour plot of Y=f(A,C)

图9 Y=f(B,C)的响应面和等高线分析图Fig.9 Response surface and contour plot of Y=f(B,C)

2.2.4 验证实验 为了检验响应面法的可行性,采用得到的最佳工艺参数进行卵白蛋白乳化活性测定的验证实验,同时考虑到实际操作和生产的便利,以酶解时间195 min,pH9.0,酶解温度38 ℃为最佳,进行3次重复性实验,得到卵白蛋白乳化活性平均值为0.967±0.031,与理论值的标准偏差为1.15%。因此,响应面法对卵白蛋白酶法改性工艺条件的优化是可行的,得到的工艺条件具有实际应用价值。

2.3 乳化液微观结构观察

乳化液微观结构观察主要从两个方面分析,一个是液滴大小,另一个是液滴密集程度[1]。经结果(图10)分析可知,未经酶法改性的卵白蛋白乳化液液滴较大、分散稀松,而经过最优化条件酶解后,获得的卵白蛋白乳化液液滴细小、分散密集,由此可推断酶法改性能有效改善卵白蛋白的乳化活性。

图10 卵白蛋白乳化液显微图像(100×)Fig.10 Microscopic images of droplets of ovalbumin emulsions(100×)注：a:未改性,b:酶法改性。

3 结论

在单因素实验结果基础上,采用响应面法优化了碱性蛋白酶改善卵白蛋白乳化活性工艺参数。通过单因素实验和Box-Behnken中心组合优化实验,得到最佳酶解工艺条件为:底物浓度1.0%、酶用量30000 U/g、酶解时间195 min、pH9.0、酶解温度38 ℃。在此工艺条件下,实际乳化活性可以达到0.967±0.031,与未经改性处理样品的0.51相比提高89.61%,与理论值能较好的吻合。该模型能预测实际酶解产物乳化活性。采用碱性蛋白酶酶法改性能显著改善卵白蛋白的乳化性,且改性条件温和、无化学方法导致的环境污染,期望能为工业化改性生产专用高乳化性卵白蛋白粉提供可行方法。

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Improving emulsifying property of ovalbumin with enzymatic modification

XU Mei-yu,WANG Xi-xi,HUANG Qun*,LIN Chao,SONG Hong-bo,WANG Yi-wei,TENG Hui

(College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

The emulsifying activity and emulsion stability of ovalbumin were improved by enzymatic modification with Alcalase. On the basis of single factor experiments,and the emulsifying activity as response value,enzymatic hydrolysis duration,pH value and enzymatic hydrolysis temperature were chosen as impact factors. The Box-Behnken center-united experimental design principle was used to design the experiments and the response surface analysis was adopted. The optimal enzymatic modification conditions by the response surface analysis were showed as follows:enzymatic hydrolysis duration 195 min,pH value 9.0,enzymatic hydrolysis temperature 38 ℃,substrate concentration 1.0% and Alcalase usage 30000 U/g. Under the optimal conditions,the emulsifying activity of ovalbumin was 0.967±0.031 increasing with 89.61%,indicating that the effect of improving the emulsification of ovalbumin with alkaline protease modification was ideal.

ovalbumin;alcalase;enzymatic modification;emulsifying activity;emulsion stability

2016-09-01

许美玉(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白质工程，E-mail：1767101093@qq.com。

*通讯作者:黄群(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：畜产品加工与食品生物技术，E-mail：huangqunlaoshi@126.com。

国家公益性行业(农业)专项(201303084)。

TS253.4

A

1002-0306(2017)08-0150-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.021