无患子皂苷的生物活性与生产开发

姚卫蓉，伍 恒，魏敏平，谢云飞

（江南大学食品学院，江苏无锡 ，214122)

无患子皂苷的生物活性与生产开发

姚卫蓉，伍 恒，魏敏平，谢云飞

（江南大学食品学院，江苏无锡 ，214122)

无患子果皮中含有丰富的皂苷和倍半萜糖苷，是天然的非离子表面活性剂，其提取液具有非常强的表面活性以及杀菌、消炎、抗肿瘤等生物活性。本研究以无患子皂苷浓缩液为原料，采用生物发酵法纯化无患子皂苷，皂苷纯度提高到75.50%；同时评价其对炭黑污布、蛋白污布、皮脂污布的去污能力，去污值分别达到99.1%、54.1%、63.2%；此外，还考察了其对埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、红色毛癣菌、痤疮丙酸杆菌这4种常见皮肤致病菌的抑制效果。实验结果表明，无患子发酵液对红色毛癣菌、痤疮丙酸杆菌表现出较强的抑菌活性，二者的最低抑制浓度(MIC)分别为0.39 mg/mL、1.29 mg/mL。本研究结果表明无患子皂苷具有良好的表面活性和抑菌性，为进一步开发利用无患子资源提供了基础信息。

非离子表面活性剂；无患子皂苷；生物活性；发酵；去污能力；抑菌活性

无患子，亦称洗手果、油罗树，是分布于热带以及亚热带国家的一种无患子科落叶乔木，其根、叶、果皮、种子等均具有很强的药用价值，是不可多得的自然资源。无患子果皮中富含的三萜皂苷类和倍半萜糖苷均具有优良的非离子表面活性，能降低水的表面张力，泡沫丰富细腻，去污力强，抗硬水性强，溶解性好，可用作天然洗涤剂，还可用来制造牙膏、洗发香波及各种洁肤护肤化妆品等[1,2]；同时，随着近年来无患子化学成分提取研究的不断开展，其药用价值得到了很大的开发，大量研究表明：其提取液具有非常强的杀菌[3]、消炎[4]、抗肿瘤[5]、保肝降压[6]等生物活性。

目前对无患子皂苷活性物质的研究大都采用无患子粗提液作为原材料[7]，但由于其中含有大量的糖及少量的蛋白质、金属离子等杂质，因此，并不能真实反映无患子皂苷所具有的良好性能。

鉴于此，本实验在无患子皂苷水提浓缩液的基础上，采用微生物发酵方法对无患子皂苷水提浓缩液进行纯化，利用酵母菌将其中糖类作为碳源、蛋白质作为氮源的特点，以达到提高无患子皂苷纯度的目的。同时考察了无患子皂苷发酵液对炭黑污布、蛋白污布、皮脂污布的去污能力，以及对埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、红色毛癣菌、痤疮丙酸杆菌4种常见皮肤致病菌的抑菌活性，旨在为以无患子为原料的日用品开发提供基础支撑。

1 实验

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂

无患子水提浓缩液：福建省源华生物科技有限公司提供。香草醛、高氯酸、冰醋酸、葡萄糖、氯化钠、乙酸钠、可溶性淀粉、L-半胱氨酸盐酸盐等均为分析纯。

1.1.2 供试菌种

安琪葡萄酒干酵母 BV818，埃希氏大肠杆菌 ATCC8099 (Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌ATCC6538 (Staphylococcus aureus)、红色毛藓菌ATCC294 (Trichophyton rubrum)：江南大学食品学院提供；痤疮丙酸杆菌 ATCC6919 (Propionibacterium acnes)：广东省微生物菌种检测中心提供。

1.1.3 培养基

营养琼脂培养基配方：蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏3.0 g、氯化钠5.0 g、琼脂15.0 g、蒸馏水1000 mL；厌氧培养基配方：蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏10 g、葡萄糖5.0 g、氯化钠5.0 g、酵母膏3.0 g、乙酸钠3.0 g、可溶性淀粉1.0 g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g、琼脂15.0 g、蒸馏水1000 mL；沙氏培养基配方：蛋白胨10.0 g、葡萄糖40.0 g、琼脂20.0 g、蒸馏水1000 mL。

1.1.4 实验仪器

TU-1900双束紫外可见分光光度：日本岛津公司；PYX-DHS-50×65-BS隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗机械厂；W501恒温水浴锅：上海申顺生物科技有限公司；R-501旋转蒸发器：上海申顺生物科技有限公司；DELTA320型pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；RJ-TDL-50A低速台式大容量离心机：无锡瑞江。

1.2 测定方法

1.2.1 无患子皂苷浓缩液的纯化

将干酵母按1.5%的接种量接种至无患子皂苷浓缩液(皂苷纯度44.63%)中，于自然pH、30 ℃下静置发酵4天，然后在8000 r/min 离心10 min 以除去菌体，从而得到无患子皂苷发酵液，并对其进行皂苷含量、可溶性固形物含量的测定。

无患子皂苷含量的测定采用香草醛－冰醋酸法[8]。

可溶性固形物含量的测定参考伍恒等[9]的研究，简述如下：准确量取10 mL发酵液于铝盒中→60 ℃水浴蒸干→真空干燥(60 ℃、真空度93.3-98.7 kPa)5 h→冷却→恒重。

1.2.2 无患子皂苷发酵液去污力的测定

称取无水CaCl216.5 g和MgSO4·7H2O 24.7 g，加蒸馏水10 L，取1 L冲稀至10 L即为250 ppm硬水。将待测样品及标准洗衣粉用250 ppm的硬水配制成表面活性剂含量0.2%的溶液。实验前先用光电比色计进行读数，利用反射光的强弱可以读出布面的白度。先将白瓷板校正（用滤光片500号，以标准白碳酸镁为100校正），将污布剪成24块圆布(每块直径为6 cm)，然后分别将每块污布的正反两面的5个部位读出反光度，取其平均值，即可进行洗涤实验。实验时先在去污机的24只瓶内倒入300 mL配制好的表面活性剂溶液，在预热槽中预热至43 ℃即放入污布，装入转轴架中在45 ℃下转动1 h，取出用自来水冲洗，放在搪瓷盘中晾干后进行读数。

1.2.3 无患子皂苷发酵液抑菌活性的测定

菌悬液的制备：实验菌株经活化后，挑取单菌落，采用麦氏比浊法用无菌生理盐水稀释成浓度约为106 cfu/mL的菌液，置于4 ℃备用。

试管二倍稀释法：用蒸馏水将无患子发酵液稀释至皂苷含量为100 mg/mL的水溶液，然后将10支灭菌试管排成一列、编号，各加入双倍营养的营养琼脂培养基(红色毛癣菌用沙氏培养基，痤疮丙酸杆菌用厌氧培养基)1 mL，在第一管内加入1 mL待测样品，混匀后吸取1 mL到第2管，混匀再取1 mL到第3管，依次类推到第9管，弃去1 mL，第10管不加提取物。待培养基凝固后，每管加入菌液20 μL，混匀，置于37 ℃(红色毛癣菌，30 ℃)培养箱(痤疮丙酸杆菌，在厌氧条件下)静置培养 24 h(红色毛癣菌及痤疮丙酸杆菌，48 h)。结果判定：培养基表面无菌落或菌丝表示无细菌生长，有菌落表示有细菌生长，以能抑制细菌(红色毛癣菌)生长的发酵液最高稀释度作为其最低抑菌浓度(MIC)，以生理盐水做为空白对照，氨苄青霉素溶液作为细菌的阳性对照，那他霉素作为红色毛癣菌的阳性对照。

2 结果与讨论

2.1 无患子总皂苷的纯化

按1.2.1所述方法进行发酵实验，结果如表1所示。

表1 无患子皂苷浓缩液及其发酵液的理化性质

由表1可知，无患子皂苷水提浓缩液经发酵过后可溶性固形物含量从140.00 g/L降低至75.00 g/L，无患子皂苷纯度从44.63%上升到75.50%，分析原因可能是由于无患子皂苷浓缩液中糖和蛋白质等营养物质被酵母菌优势利用于生长，相反，皂苷类活性成分被利用程度较弱，并且副代谢产物产生很少，从而，纯度得到明显提高。近几年来，用于分离纯化皂苷的方法较多，包括水提醇沉法[10]、正丁醇萃取法[11]、超滤膜分离法[12]、大孔树脂法[13]以及微生物发酵法[14]等，各种方法所受影响因素不一，因此，各具优劣。其中微生物发酵法是指一些物化方法较难去除的大分子物质通过微生物发酵进行分解，从而达到纯化的目的，并且效果十分显著。微生物发酵法所得皂苷纯度比常规水提法所得产品纯度高，同时在发酵过程中可对皂苷进行改性，从而提高皂苷的生物活性。皂苷纯度提高的幅度主要取决于菌株的耗糖能力[15]，赵丹青等[16]在酵母膏培养基接种乳酸菌来对无患子皂苷水提液进行精制，实验结果发现：葡萄糖和甘露糖完全消耗，并且溶液表面张力变化不大，表明无患子皂苷在发酵过程中具有一定的稳定性；张翠等[17]在无患子水提液基础上，比较了水提醇沉法、絮凝法、正丁醇萃取法和米曲霉发酵纯化无患子皂苷的效果。结果表明：接种米曲霉发酵效果最佳，按3%的接种量在30℃摇床发酵7天后所得皂苷纯度从48.71%提高至82.47%。本实验通过在无患子皂苷水提浓缩液中接种酵母菌，实验得出皂苷纯度从44.63%提高至75.50%，由此可知：酵母菌发酵所得皂苷纯度提高的幅度虽略低于米曲霉发酵的结果，但米曲霉发酵周期相对较长。从经济效益角度考虑，接种酵母菌更有利于工业化生产。

2.2 无患子皂苷发酵液的去污力

无患子皂苷发酵液对3种具有代表性污布的去污力结果如图1所示。

图1 无患子皂苷发酵液的去污力

实验结果表明：无患子皂苷浓缩液发酵后，对炭黑污布、蛋白污布及皮脂污布的去污力分别从89.0%、45.2%、52.3%提高至99.1%、54.1%、63.0%。可见无论是哪种类型的污布，无患子皂苷发酵液的去污力均比无患子皂苷浓缩液高。张翠[10]曾考察了无患子皂苷水提液在发酵过程中pH的变化情况，实验得出发酵4天后pH值从4.12升至7.21，他们认为可能是在发酵过程中，随着发酵液中糖的减少，蛋白质在分解成氨基酸后进一步生成胺类物质，呈碱性的产物不断增加，从而导致pH上升；同时pH对洗涤剂的去污能力有一定的影响，碱性越大，洗涤效果就越好，但一般以中性较好。本实验以无患子皂苷浓缩液为原料，经酵母菌发酵后pH值从4.41升至6.92，结合去污力实验结果，正好验证了张翠的猜想。此外，对于炭黑污布，无患子皂苷浓缩液经发酵纯化后的去污力虽仅提高11.3%，但其优势更加明显，近乎达到完全去污；相反，对蛋白和皮脂污布发酵液的去污力提高了近20%，但仍然没有达到《衣料用液体洗涤剂》的标准要求。由此得知：在相同的测试条件下，去污力与污垢的成分密切相关。为增强对蛋白和皮脂的去除效果，可试图开展将无患子皂苷发酵液与其他表面活性剂进行复配的后续研究。

2.3 无患子皂苷发酵液的抑菌性

无患子皂苷发酵液对几种常见皮肤病原菌的抑制效果如表2所示。

表2 无患子皂苷发酵液对4种常见皮肤病原菌的抑菌性

由表2可以得出：无患子皂苷发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌和红色毛癣菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为25.00 mg/mL、12.50 mg/mL、1.29 mg/mL和0.39 mg/mL。由此表明：无患子皂苷发酵液对红色毛癣菌抑制效果最佳，痤疮丙酸杆菌次之，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌稍差。从上述结果还可以看出：无论是无患子皂苷浓缩液还是无患子皂苷发酵液，二者对革兰氏阳性菌的抑制作用均优于革兰氏阴性菌，分析原因可能是由于他们的细胞壁结构不同所致。Tamura等[18]研究了无患子甲醇提取物的抑菌活性，结果表明：实验用样对革兰氏阳性菌具有中等生长抑制活性，对革兰氏阴性菌抑制活性较弱，这跟本实验的结果相似。此外，无患子皂苷浓缩液发酵后对实验所选菌种的抑菌性稍有增强，而有些保持不变，说明在发酵过程中，酵母菌不利用或较少利用抑菌活性物质，并且可能由于发酵后皂苷纯度提高，所以对痤疮丙酸杆菌和红色毛癣菌抑制活性增强，但具体是哪种或哪几种皂苷成分发挥作用有待进一步研究。

3 结论

无患子假种皮中含有大量的皂苷成分，本实验以其水提浓缩液为原料进行了发酵纯化，并对所获得的发酵液进行了去污力、抑菌活性研究。

3.1 采用耗糖能力强的酵母菌发酵来实现对无患子皂苷的纯化，数据显示皂苷纯度提高了31.00%左右；

3.2 通过3种具有代表性的污布评价了无患子皂苷发酵液的去污能力，结果表明，其去污效果良好，对炭黑污布甚至能达到完全去污；

3.3 抑菌实验表明，无患子皂苷发酵液对常见的4种皮肤致病菌均具有抑制效果，其中以红色毛癣菌、痤疮丙酸杆菌尤为明显。

本实验提供了一种低成本、高纯度、操作周期短的无患子皂苷纯化方法，有利于大规模的工业化生产，为进一步分离纯化无患子皂苷成分提供了数据参考，同时为基于无患子皂苷的日化产品开发奠定了科学依据。

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Analysis on the Bioactivity and Development of Sapindus Saponins

Yao Weirong⋆, Wu Heng, Wei Minping, Xie Yunfei
( School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi214122, China)

Rich in saponins and sesquiterpene glucosides, the pericarp of Sapindus mukurossi is considered as natural non-ionic surfactants. The extract of Sapindus pericarp has strong surfactivity and biological activities such as anti-inflammatory, antimicrobial and antitumor activities. A fermentation process was performed to purify saponins by BV818 yeast based on the concentrated saponins solution of Sapindus pericarp. The results showed that the purity of saponins increased to 75.50%. The detergency of fermentation product was also determined, and the detergency for carbon black dirty cloth, protein dirty cloth and sebum dirty cloth reached 99.10%, 54.10% and 63.20%, respectively. In addition, this paper investigated the inhibitory effect of fermentation product against 4 kinds of common skin pathogens including Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Trichophyton rubrum and Propionibacterium acnes. The antimicrobial test showed the strong antimicrobial activity of fermentation product against Trichophyton rubrum and Propionibacterium acnes with minimum inhibitory concentration (MIC) of 0.39 mg/mL and 1.29 mg/mL, seperately. The results of this study underscored that Sapindus saponins have excellent surface activity and antimicrobial activity, which would provide basic information for further development and utilization of Sapindus mukurossi.

Sapindus saponins; bioactivity; fermentation; detergency; antimicrobial activity

TQ423.2；TQ649.6

A

1672-2701（2017）04-32-05

姚卫蓉女士，教授，博士，研究方向：食品安全与质量控制。E-mail:yaoweirongcn@ jiangnan.edu.cn。