基于SSR标记的桃品种遗传多样性分析及遗传相似系数比较

叶宇芸， 王清明,2， 马建伟， 张银平， 陈其阳， 汤浩茹， 张 勇

(1 四川农业大学 园艺学院，四川 成都 611130； 2 广元市农业科学研究院，四川 广元 628017)

基于SSR标记的桃品种遗传多样性分析及遗传相似系数比较

叶宇芸1， 王清明1,2， 马建伟1， 张银平1， 陈其阳1， 汤浩茹1， 张 勇1

(1 四川农业大学 园艺学院，四川 成都 611130； 2 广元市农业科学研究院，四川 广元 628017)

【目的】利用NCBI数据库中桃的EST信息开发SSR引物,分析成都平原主栽桃品种的遗传多样性，探讨各遗传相似系数在桃SSR分析中的适用性，以期为桃种质资源的研究提供参考。【方法】利用来自NCBI-EST数据库的100对SSR引物对12个不同形态的桃品种进行PCR扩增，分析筛选20对多态性好、稳定性高且均匀分布于桃8个连锁群的引物对40个桃品种进行PCR扩增，并采用5个遗传相似系数分别对扩增结果进行分析。【结果】使用20对引物共检测出68个多态性等位基因位点，每对引物的等位基因数在2～5之间, 平均为3.4。多态信息含量在0.36～0.73间变化，平均为0.54。Jaccard相似系数为0.106～1.000; Jaccard系数的共表型相关系数rc最高，为0.772; Dice系数次之，为0.719; Jaccard和Dice系数的系统树一致性最高，CIc为1。Nei’s基因多样性指数在种级水平上和类群水平上分别为0.603和0.374，相应的Shannon’s信息指数分别为1.041和0.591。40个桃品种在聚类中首先分为观赏桃和食用桃2大类，再细分为各类群，聚类结果与传统系谱基本吻合。【结论】基于NCBI数据库中桃的EST信息开发的SSR引物多态性较好，可用于桃的SSR分析。Jaccard和Dice系数适合桃的SSR分析。桃品种总体遗传多样性较丰富，但水蜜桃品种仍需加强种质创新。

桃； 遗传多样性； 遗传相似系数； EST-SSR； 引物筛选

桃Prunuspersica为蔷薇科桃属重要果树，在长期的人工驯化和选择中形成了适应不同生态条件、满足不同需求的类型，这些资源为进一步改良桃的相关性状提供了基础，了解这些资源是利用的前提。中国的桃种质资源十分丰富，目前国内各种园圃共收集保存了2 000余份桃种质资源[1]，桃作为全世界栽培最广泛的落叶果树之一，已遍布全球。《中国果树志·桃卷》[2]中，桃品种按形态学、品种类群和生态类群等进行分类，这有助于栽培生产和果品利用，但部分品种仅依靠形态特征很难识别，而形态学标记位点较少且易受环境因素的影响[3]，开展桃树分子标记辅助分类具有重要意义。

简单序列重复(Simple sequence repeat, SSR)标记因多态性丰富、重复性好、检测方便、共显性、标记覆盖整个基因组且均匀分布等特点，已成为分子育种中最重要的遗传标记之一[4]。然而，桃的可用SSR引物较少，蔷薇科其他植物的SSR引物更为稀少。2013年，Verde等[5]基于桃不同器官转录组数据研究后上传至NCBI共80 797条ESTs序列，为挑选更好的桃SSR引物提供了丰富的资源。

聚类分析是应用于种质资源亲缘关系鉴定、新品种鉴定和遗传多样性分析等研究的一种方法。Bouhadida等[6]利用聚类分析鉴别了94份西班牙桃品种；张俊佳等[7]完成了桃新品种‘保佳红’亲缘关系的鉴定；廖安红等[8]分析了71份桃资源的遗传多样性。聚类分析因用途广泛而在桃种质资源的研究工作中占有非常重要的地位。遗传相似系数的选择为聚类分析的重要一环，过去的研究中对于遗传相似系数的选择多基于默认设置或惯性，而基于不同的遗传相似系数进行聚类分析，其结果存在较大差异[9]，故选择一个合适的遗传相似系数对于后续各种基于聚类分析进行的工作显得尤为重要。

本研究以成都平原主栽的40个桃品种为研究对象，根据现有EST序列设计100对SSR引物，从中挑选出20对可用引物，分析了成都平原主栽桃品种的遗传多样性，利用SSR标记探讨了不同的遗传相似系数在桃的SSR分析中的适用性，以期为桃种质资源的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

基于《中国果树志:桃卷》[2]中的各品种类群对成都平原桃的主栽品种进行取材，本试验所用40份材料(表1)分别来自四川省农业科学院龙泉资源圃、华阳资源圃和四川农业大学临济资源圃。

表1 试验种质和分类

1.2 引物设计及筛选

利用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)对NCBI数据库ESTs序列处理后所得的EST序列进行SSR位点搜索，选取含SSR位点且最容易发生变异的二核苷酸重复EST-SSR引物，搜索标准为：二核苷酸重复基序的最少重复次数为6次，且间隔序列小于100 bp，然后利用Primer3模块(http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/1.1.4/primer3-1.1.4-WINXP.zip/download)设计EST-SSR引物，设计标准为：产物大小100～280 bp,引物长度18～27 bp,复性温度57～63 ℃，上下游引物相差小于3 ℃。

利用UltraEdit软件对自NCBI下载的桃全基因组序列进行处理，具体方法为：在软件中搜索“scaffold_1”、“scaffold_2”、“scaffold_3”直至“scaffold_8”，分别记录各连锁群的始末位置，再将供试引物序列在软件中搜索，以确定各引物在连锁群上的分布情况，并结合引物验证结果筛选可用引物。

1.3 DNA提取及引物PCR验证

采用CTAB法提取DNA。PCR扩增在Bio-rad DNA Engine Single bay PCR仪(Eppendorf, 德国)上进行。SSR-PCR采用包含10×10-9mo1 引物，40 ng DNA模板，2 UTaqDNA聚合酶，2.5 μL 10×Buffer(含Mg2+)，7.5×10-6mol dNTPs，50×10-6mol Mg2+共25 μL反应体系。其反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57～63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min， 32个循环；72 ℃延伸5 min；于4 ℃保存20 min，得扩增产物。PCR扩增产物使用80 g·L-1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，银染至条带清晰为止，照相并记录。

1.4 数据分析

利用PIC_CALC软件得到SSR位点多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)，结合多态性条带率来评价位点的扩增情况。利用NTsys-2.10e计算5个遗传相似系数(表2)，并用非加权组平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)建立相应的系统树。利用Mantel检验[10]分析遗传相似矩阵间相关性；采用Cophenetic模块计算共表型相关系数(rc)，此系数可检验聚类方法和原始遗传相似矩阵间的拟合优度；采用CONSENSUS-consensus tree模块计算聚类树状图系统树一致性指数(Consistency index，CIc)，以估计各系统树间的相对一致性[11]。

表2 不同遗传相似系数的计算方法

Tab.2 Calculation methods of five genetic similarity coefficients

相似系数计算公式1)区间SimpleMatching(SM)(a+d)/(b+c)(0，1)Jaccard(J)a/{[(a+d)+(b+c)]-d}(0，1)RusselandRao(RR)a/[(a+d)+(b+c)](0，1)Dice2a/(2a+b+c)(0，1)Phi(ad-bc)/(a+b)(c+d))(a+c)(b+d)(-1，1)

1)a表示品种i、j共有条带数；b表示品种i特有条带数；c表示品种j特有条带数；d表示品种i、j共有缺失条带数。

2 结果与分析

2.1 SSR引物筛选及扩增结果

根据已公布的80 797条桃EST序列，去除低质量和冗余的9 965条，剩余的70 360条包含38.2 M信息量，占桃全基因组的16.8%；共检测得12 519个SSR位点，位点出现总频率为14.6%。利用Primer3模块从12 519条含有SSR位点的EST序列中设计了1 306对二核苷酸重复的SSR引物。利用随机分层抽样的方法，按照重复单位的重复数(5～10、10～15、16～20、20～25、25～n)将二核苷酸重复引物分为5组，分别从5组中随机抽取相同数量(各20对)共100对引物。利用12个不同形态的桃品种(早凤王、早红蟠、锦园、春雪、曙光、千姬、寿红、红垂枝、白垂枝、菊花桃、红叶桃、报春)对100对二核苷酸SSR引物进行了验证，扩增结果表明等位基因数量≥3的引物占43%，扩增情况较好。利用UltraEdit软件对自NCBI下载的桃全基因组序列进行处理，确定了各引物在连锁群上的分布情况，结合引物验证结果，筛选出20对均匀分散于8个连锁群的、等位基因数量多、稳定性高的引物(表3)以代表全基因组信息，对40个桃品种进行PCR扩增。

20对SSR引物的扩增结果(表3)显示，共扩增出68个多态性等位基因位点，单对引物扩增条带数变幅为2～5，平均每对引物扩增出约3.4个多态性条带，多态信息含量(PIC)介于0.36～0.73，平均值为0.54，表明这些引物PIC值较高，可用于桃种质资源的鉴定和研究。

2.2 遗传相似系数分析

基于不同遗传相似系数的品种遗传相似度矩阵，对成对矩阵的相关系数进行计算的结果(表4)显示，各系数间成对的相关系数变幅为0.861～0.996。SM系数与Phi系数相关性最高，为0.996；RR系数与SM系数相关性最低，为0.861。

表3 20对桃EST-SSR引物信息

1)括号内的英文字符为简单重复序列，括号外的数字为该序列的重复次数。

表4 基于不同相似系数的遗传相似性矩阵间的相关系数

Tab.4 Correlation coefficients of genetic similarity matrix based on different similarity coefficients

相似系数PhiSMJaccardRRSM0．996Jaccard0．9760．959RR0．8980．8610．954Dice0．9820．9630．9900．961

不同遗传相似系数的UPGMA系统树一致性分析结果(表5)显示，系统树一致性指数(CIc)介于0.474～1.000。Dice系数与Jaccard系数的系统树一致性最高，CIc为1.000，表明2个系统树的聚类结果完全一致。最低的是RR系数与SM系数，CIc为0.474。系统树的一致性分析结果表明不同的遗传相似系数进行聚类分析，其结果存在较大差异。

表5 基于不同相似系数的UPGMA系统树的一致性指数

Tab.5 The consistency indexes of UPGMA system trees based on different similarity coefficients

相似系数PhiSMJaccardRRSM0．868Jaccard0．9740．842RR0．5000．4740．500Dice0．9740．8421．0000．500

5个遗传相似系数的建树结果表明，品种间遗传相似度在UPGMA聚类分析中有较良好的表现，各系数的共表型相关系数(rc)的变幅为0.660～0.772，其中Jaccard系数的rc最大, 为0.772， Dice、PHI、SM和RR系数的rc分别为0.719、0.709、0.708和0.660。

2.3 遗传多样性分析

利用Jaccard遗传相似系数对桃品种间遗传相似度进行计算，建立UPGMA系统树(图1)。

20对引物在40份桃种质上的Jaccard系数变幅为0.106～1.000，品种‘晚湖景’和‘红垂枝’的遗传相似系数最小，为0.106；‘单粉’和‘洒红’的遗传相似系数最大，为1.000。由图1可知，在相似系数为0.300时，40个桃品种分为了观赏桃品种和食用桃品种2个大类，两者表现出了明显的界限；各品种基本表现为同一类群品种聚在一起，仅个别品种发生类群间“跳跃”，聚类结果与传统系谱基本一致。在相似系数为0.360时，可将供试材料分为6组。第I组包括7个水蜜桃品种；第II组为3个黄桃品种；第III组则包括6个油桃品种和1个蟠桃品种；第IV组包括5个硬肉桃品种，1个黄桃品种和1个白桃品种，3个来自日本的品种(‘红清水’、‘千丸’和‘千姬’)聚在了一起；第V组主要由12个直枝型观赏桃品种组成；第VI组则为3个垂直型观赏桃品种。

图1 基于Jaccard系数的聚类分析

供试材料的Nei’s基因多样性指数在种级水平和类群水平分别为0.603 0和0.374 0。在类群水平上，直枝桃品种群的基因多样性指数最高，为0.858 4，除仅包含1个品种的蟠桃类群(0.315 8)、白桃类群(0.236 8)和寿星桃类群(0.250 0)外，水蜜桃的基因多样性指数最低，为0.369 7。水蜜桃的期望杂合度与观测杂合度也最低，分别为0.398 7和0.310 7，均远低于种级水平的0.611 0和0.405 0。Shannon’s信息指数与基因多样性指数呈正相关，类群的基因多样性指数越高，其Shannon’s信息指数也越高(表6)。

表6 桃品种遗传多样性水平

3 讨论与结论

桃EST-SSR基序类型从单核苷酸到六核苷酸共159种，其中二核苷酸重复序列占比最大，达36.43%，其最容易产生变异，相应的引物多态性也均较丰富。本试验中40个桃品种在20个SSR位点上共扩增出68个多态性条带，每对引物平均为3.4，与史红丽等[12]在47个桃品种上报道的3.4个相同，低于俞明亮等[13]在135份桃种质中平均每对引物扩增出5.68个多态性条带。这并不代表本试验中的引物多态性低，只实践证明了供试材料种质数量越大，遗传背景越丰富，越容易扩增出更丰富的条带。本试验20对引物PIC平均为0.54，且多态率均为100%，可见其多态性均较丰富。

Murguía等[14]通过假定矩阵分析，指出Jaccard和Dice系数的分类拓扑结果和矩阵结构所产生结果均一致。本研究中Dice和Jaccard系数的相关系数为0.990，且两者的系统树一致性指数为1.000，但Jaccard系数的rc高于Dice系数，表明二者的计算原理可能相似，但Jaccard系数的聚类结果与其相似性结构矩阵间的相关性高于Dice系数。Phi和SM系数的聚类结果与原始遗传相似矩阵间的拟合度则次于Dice系数。RR系数不适于SSR标记的数据分析，其rc最低，且桃等位变异数量大，使基于RR系数的相似性结构矩阵中种质间遗传相似度明显降低。总体上，Jaccard和Dice系数适合桃的SSR分析。

Nei’s基因多样性指数为评价种质遗传多样性的重要指标，程中平等[15 ]于2004报道的桃基因多样性指数在种级水平上为0.150，2007年陈巍等[16]和2014年魏姗姗等[17]检测出的种级水平的桃基因多样性指数分别为0.224和0.565，本研究检测出种级水平的基因多样性指数为0.603，可见近年来桃的变异程度正逐步上升，种质之间的遗传交流大，桃整体上创新种质丰富。垂枝桃与其他类群桃品种间的亲缘关系较远，最先聚为1组，与程中平等[15]的各类群聚类图结果相同，表明其变异程度较大，推测其可能较直枝桃更为进化[18]。在本研究中，供试的9个类群的遗传多样性，由于受资源圃材料所限，垂直桃等取样较少，可能检测到较低的遗传多样性，但是水蜜桃在供试类群中数量仅次于直枝桃，它的遗传多样性却比样本数少的垂枝桃等的3个类群的遗传多样性低，与程中平等[15]的研究结果相似，表明近年来成都平原地区水蜜桃的遗传多样性保持在较低的水平，可能是由于其主栽品种数量较少，需要加强种质创新。第IV组中的‘红清水’、‘千丸’和‘千姬’均为日本品种，它们互为不同的类群的桃品种，在聚类时表现出较近的亲缘关系，表明地理因素为影响种质基因交流的主因[19]。进行种质分析时，可能出现同物异名的现象[20]，本研究中‘单粉’与‘洒红’于组V中聚在了一起，且相似系数为1.000，前人的研究中也存在无法将二者分开的情况，但‘单粉’与‘洒红’的形态特征具有较明显差异，基本排除了同物异名现象[20]，表明这2个品种可能具有相同或相近的亲本来源，同时也说明了开发并筛选验证桃可用SSR引物的重要性。

桃在我国种植范围广且栽培历史悠久，本试验中所用的桃品种遗传相似系数差异较大，表明了我国为桃的遗传多样性丰富地区，另一方面由于各桃品种遗传资源背景相对比较复杂，在对桃进行分类和亲缘关系鉴定等工作时，需要借助分子标记与传统形态标记来共同完成。目前，桃的可用SSR标记数量较少，蔷薇科其他物种的SSR标记数量也十分有限，因此在进行园艺植物种质创新的同时也需加强与其重要农艺性状相关分子标记的开发与筛选工作。

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【责任编辑 庄 延】

SSR analysis on genetic diversity of peach cultivars and comparisonof different genetic similarity coefficients

YE Yuyun1, WANG Qingming1,2, MA Jianwei1, ZHANG Yinping1,CHEN Qiyang1, TANG Haoru1, ZHANG Yong1

(1 College of Horticulture, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;2 Guangyuan Academy of Agricultural Sciences, Guangyuan 628017, China)

【Objective】 To develop SSR primers based on peach ESTs in NCBI database, analyze genetic diversity of the major peach cultivars in Chengdu plain, investigate the applicability of different genetic similarity coefficients in SSR analysis of peach, and provide references for research on peach germplasm resources. 【Method】In total 100 pairs of SSR primers selected from NCBI-EST database were used in PCR amplification for 12 peach cultivars with various morphology. Twenty primers which had high polymorphism and stability, and evenly distributed in eight linkage groups were selected for PCR amplification of 40 peach cultivars. Five genetic similarity coefficients were used to analyze the amplification results. 【Result】Using 20 SSR primers, 68 polymorphic alleles were detected. The number of alleles per locus ranged from 2 to 5, with an average of 3.4. The polymorphism information content ranged from 0.36 to 0.73, and with an average of 0.54. The Jaccard genetic similarity coefficient ranged from 0.106 to 1.000. The Cophenetic correlation coefficient (rc) of Jaccard coefficient was the highest being 0.772， followed by Dice coefficient being 0.719. The consistency of consensus trees between Dice and Jaccard coefficients were the highest withCIcbeing 1.000. Nei’s gene diversity index was 0.603 and 0.374 respectively at the species level and the level of different classified groups, the corresponding Shannon’s information index was 1.041 and 0.591 respectively. The 40 peach cultivars were firstly divided into two major categories which were ornamental peach and edible peach, and then subdivided into different types of groups. The clustering result basically coincided with the traditional pedigree. 【Conclusion】The SSR primers developed based on peach ESTs in NCBI database have high polymorphism and can be used for SSR analysis of peach. Jaccard and Dice coefficients are the most appropriate for SSR analysis of peach. In general, the genetic diversity of peach is abundant, but variation of the honey peach group is relatively low, and germplasm innovation of this group needs to be improved.

peach; genetic diversity; genetic similarity coefficient; EST-SSR; primer screening

2016- 07- 31 优先出版时间：2017-04-12

叶宇芸(1994—)，男，硕士研究生，E-mail：yeyuyun690653415@qq.com；通信作者：张 勇 (1981—)，男，副教授，博士，E-mail：zhyong@sicau.edu.cn

四川省教育厅重点项目(12ZZ011)

S662.1

A

1001- 411X(2017)03- 0039- 07

优先出版网址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170412.1419.010.html

叶宇芸， 王清明， 马建伟， 等.基于SSR标记的桃品种遗传多样性分析及遗传相似系数比较[J].华南农业大学学报，2017,38(3):39- 45.