国产牛心包补片在羊肺动脉和主动脉补片实验中的安全性和有效性

米尔阿迪力江·阿布都帕塔尔 陆树洋 陈金淼 何 晨 王春生 洪 涛

(复旦大学附属中山医院心外科 上海 200032)

国产牛心包补片在羊肺动脉和主动脉补片实验中的安全性和有效性

米尔阿迪力江·阿布都帕塔尔▲陆树洋▲陈金淼 何 晨 王春生 洪 涛△

(复旦大学附属中山医院心外科 上海 200032)

目的 本研究对国产牛心包补片的安全性和有效性进行评价,为进一步临床应用提供实验基础。方法采用绵羊肺动脉及降主动脉补片植入模型,以4只羊作为实验组,在肺动脉干和降主动脉干两处共植入8枚国产牛心包补片;以2只羊作为对照组,在肺动脉干和降主动脉干两处共植入4枚进口牛心包补片。术前对所有动物进行常规生化检查,术后第1个月、第2个月随访超声心动图,第3个月时进行取材,比较两组植入补片的内皮化、炎症和钙化程度等。结果 (1) 所有动物均存活,未发生手术相关并发症;(2) 超声心动图第1个月、第2个月的结果显示肺动脉和主动脉补片内无缝合处漏血、无钙化、无血栓形成、无赘生物、无明显动脉瘤样扩张;(3) 肉眼观察两组补片均无内膜增生,厚度和韧度较术前无明显改变;两组补片内膜光滑,均无肉眼可见的钙化和异物。(4) 微生物学检测提示两组补片均未出现微生物感染,均有良好的内皮化,均有炎症细胞浸润,坏死、钙化程度差异无显著统计学意义。结论 国产牛心包补片在绵羊肺动脉和主动脉补片试验中具有良好的安全性和有效性。

牛心包补片; 国产补片; 肺动脉/羊; 主动脉/羊

牛心包是一种优良的心血管修补重建材料,其具有良好的张力强度、适中的厚度及柔软度、不易感染、不漏血、不必预凝、来源广泛、价格便宜等优点,因而被广泛应用于各种先天性和后天性心脏大血管等疾病的手术治疗[1]。中国患者心血管病手术应用人工组织材料日益增加,但是国产的牛心包产品极少,大部分牛心包产品依赖从国外进口,目前批准进入中国市场的牛心包产品种类有限,因而导致牛心包来源少,价格昂贵。为了解决牛心包材料的来源和购买成本问题,生产出中国自主品牌的牛心包材料符合中国的国情需要。目前,经戊二醛处理的牛心包应用最广泛,然而钙化及退行性变是当今牛心包补片的最主要缺点[2]。本研究以新型国产牛心包作为补片,通过动物实验对其安全性和有效性进行评价,为此产品进入临床应用提供实验依据。

材 料 和 方 法

实验材料 欣吉特牛心包补片(Cingular patch,CP),由上海欣吉特生物科技有限公司提供。采用干片射线灭菌后用保存于0.625%的戊二醛溶液中,厚度为0.2～0.72 mm,补片大小为6 cm×8 cm。佰仁思牛心包补片(Balmedic patch,BP)购自北京佰仁医疗科技有限公司。采用化学灭菌后保存于戊二醛溶液中,补片厚度为0.2～0.6 mm。

实验分组 2岁左右绵羊(上海汇智赢华医疗科技研发有限公司动物部),雌雄不拘,体质量40～45 kg ,共6只。其中实验组4只,欣吉特牛心包片组;对照组2只,佰仁思牛心包片组。

实验步骤 通过面罩吸入异氟烷诱导麻醉,气管插管,在胃内安置胃管,绵羊右侧卧位,左第四肋间切口进入左侧胸腔,切开心包,显露心脏和大血管。使用侧壁钳,夹住需要切开的肺动脉壁,人工剪出大小为3 cm×3 cm的肺动脉壁缺口,将牛心包补片裁剪成缺口大小,4-0聚丙烯缝线连续缝合,将牛心包补片缝合在肺动脉壁上。暴露降主动脉,使用侧壁钳夹住降主动脉一侧,人工剪为大小为3 cm×3 cm的降主动脉壁缺口,将牛心包补片裁剪成缺口大小,4-0聚丙烯缝线连续缝合,将牛心包补片缝合在降主动脉壁上。仔细止血,置胸腔引流管1根,逐层缝合切口,布比卡因75 mg局部注射镇痛。

术后护理 将动物放回笼内。术后5天内,肌肉注射呋塞米20 mg,2次/日,预防胸水形成;术后1周内,肌肉注射头孢拉定2 g,2次/日,用于消炎及预防感染治疗;口服华法林3 mg至植入后1个月为止,1次/日,用于抗凝治疗。术后1周内每天监测绵羊的体温、心率和呼吸频率以及切口愈合情况。

检测方法

生化检查 术后第3个月,绵羊处死前采集外周血标本,检测白细胞、中性粒细胞计数等来评估术后感染。测量国际标准化比值(international normalized ratio,INR)、血清钙离子反应血液凝固和钙含量。测磷酸肌酸酶、尿素、肌酐等反映术后并发症等其他问题。

超声心动图 术后1个月、2个月在无麻醉状态下进行右侧卧位体外经胸超声心动图检查,以获得心脏图像来评估植入的牛心包补片。以是否有牛心包缝合处漏血、有无钙化、有无血栓形成、有无赘生物等来进行评价。

组织病理学 动物通过面罩吸入异氟烷持续麻醉状态下颈动脉切割放血致死,无菌切取靠近植入端约2 cm处的一段组织,分离出牛心包补片。肉眼观察牛心包补片有无赘生物、血肿、血栓形成、以及机械或生物的退化。取牛心包补片的代表性部分进行石蜡切片,用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,Masson染色和茜素红染色观察炎症、坏死、钙化程度,内皮化、细胞外结构,胶原纤维和弹性蛋白的聚集程度等。

结 果

实验结果 两组羊均存活,围手术期未出现发热、体质量下降等术后并发症。整个实验中,动物在行为学上无异常表现,食欲、体征等未明显改变。

生化检查 两组白细胞、中性粒细胞计数,INR、钙含量、肌酐和尿素等指标比较,实验组均低于对照组,但差异无统计学意义(图1)。血液微生物培养结果显示,实验组及对照组均无细菌。

超声心动图 术后1个月、2个月超声心动图显示两组补片肺动脉和主动脉处牛心包缝合处未见漏血,无钙化、血栓和赘生物形成等(图2)。两处补片均无明显动脉瘤样扩张,心脏收缩活动和各瓣膜未见异常,无心包积液。

组织病理学 肉眼观察补片可见内面光滑,厚度未见变薄,无补片内赘生物、血肿、血栓形成,无明显的瘤样膨出,未见补片撕裂、穿孔、钙化、硬化,补片变形和回缩等(图3)。

To evaluate the inflammation response of the animal,white blood cells and neutrophils in peripheral blood were tested.Meanwhile,creatinine,urea and calcium level were examined.CP:Cingular patch;BP:Balmadic patch.

After the pericardium was implanted into the artery ultrasonic cardiogram examination was taken after 2 months.A:Balmedic patch (BP) in aortic artery; B:Cingular patch (CP) in aortic artery;C:Balmedic patch (BP) in pulmonary artery;D:Cingular patch (CP) in pulmonary artery.

两组全部标本均有良好的新生内膜覆盖(图4A),均有补片交界处炎性反应(图4B)。为了量化炎性反应和坏死程度,按炎症程度评分为0～3分:0分为无炎性反应;1分为小范围炎性反应,炎症范围:0.1～0.3 mm (图4D);2分为局部较大范围的炎性反应,炎症范围:0.3～1.0 mm (图4C);3分为有弥散性炎性反应区,炎症区域大于1.0 mm (图4B),两组补片炎症评分数实验组略低于对照组(2.50±0.58vs.3.25±0.25),但差异无统计学意义(P=0.182,表1)。按坏死程度分评分为0～2分:0分为无坏死;1分为小范围坏死,坏死区域小于补片的50%;2分为大范围坏死,坏死区域大于补片的50% (图4F),实验组补片坏死分数等于对照组。按钙化程度可评分为0～3分:0分为无钙化;1分为点状小钙化,散在点状微小钙化;2分为小片状钙化坏死,钙化区域小于补片的50%;3分为大范围钙化坏死,钙化区域大于补片的50%,实验组钙化分数略低于对照组(1.25±0.50vs.1.50±0.50),但差异无统计学意义(P=0.63,表1)。上述积分规则进行统计,两组补片总分数实验组低于对照组(4.25±1.26vs.4.25±0.25),差异无统计学意义(P=0.35,表1)。Masson染色可以看出实验组胶原纤维含量比对照组多,但差异无统计学意义(图5)。茜素红染色看到两组全部标本均有钙化,两组补片钙化程度差异无统计学意义(图6)。

Gross look of the pericardium showedin the picture.A:Balmedic patch (BP) in pulmonary artery; B:Cingular patch (CP) in pulmonary artery;C:Balmedic patch (BP) in aortic artery;D:Cingular patch (CP) in aortic artery.

Microscopic views of extracted Cingular patches.Inflammation was restricted around the patch.A:Neointima was formed evenly with good endothelialization (A and E).B:Large amount of immune cells infiltrated in the tissue (1.0 mm < infiltration extent);C:Moderate immune response was seen in the patch (0.3 mm

表1 两组绵羊炎症、坏死、钙化程度的量化Tab 1 Quantification of inflammation,necrosis and calcification in the two sheep groups

Inflammation score:0=absent;1=mild (0.1 mm

To evaluate the collagenases of the implanted patches,Masson staining of the patches were taken.A:Cingular patch (CP) at the pulmonary artery;B:Balmadic patch (BP) at the pulmonary artery;C:aortic artery of the Cingular patch (CP);D:Balmadic patch (BP) at the aortic artery.

讨 论

在临床实践中,先天性心脏结构缺损、先天性或后天性血管发育异常等疾病多数需要人工材料进行手术修补和重建。这些修补材料有多种选择,包括自体心包组织、动物自然生物材料(牛心包、猪心包及马心包等)、人工合成材料等,其中应用最为广泛的为牛心包片[3]。

A and B:spot calcification;;C:moderate calcification with necrosis of the patch;D:severe calcification and necrosis.Microcalcification grades:0=absent,1=spot calcification,2=mild calcification (<50% of the patch),3=marked calcification (≥50% of the patch).

牛心包片有很好的组织相容性。处理后的牛心包片为无细胞的胶原结构,这为宿主细胞迁移和增生、内皮化和组织再生提供了天然的微环境。本研究中的两组牛心包片肉眼观察补片内面光滑,厚度未见变薄,无补片撕裂、穿孔,未见血栓形成、赘生物等。另外,牛心包容易制造并加工成0.5 mm厚度均一的补片,提供可靠的缝线滞留,缝线部位不易漏血,顺应性与自体动脉非常相似,这些特点使得牛心包片具有与自体组织高度的一致性[4]。本实验补片植入术后2个月心超可见两组牛心包片缝合处均未漏血和瘤样扩张、无钙化、硬化,补片变形和回缩等。可见牛心包片作为人工生物材料具有安全性。

当补片植入后,与原组织发生免疫反应,炎性细胞侵入,各种细胞如免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞等移行至植入补片内,使补片细胞化,促进补片新生内皮的形成。内皮细胞在维护组织正常结构和生理功能方面起着重要作用。正常自体组织表面覆盖一层完整的内皮细胞,阻止血浆蛋白的渗入和血栓形成,使血中游离的钙离子不能在胶原组织中沉积,并且有营养和自身修复作用[5]。通常,补片植入后第30天左右开始内皮化,3个月左右完全内皮化。因此本实验随访至术后第90天。实验结果显示两组补片均有完整的内皮化、新生内膜生成。当补片内皮化完成、新生内膜出现后,血栓形成、内膜感染及瘤样扩张的机率明显减少,从而延长补片寿命,减少并发症[6-7]。欣吉特牛心包采用内皮化处理技术,补片内皮化处理后可促进其完全内皮化,防止血栓和赘生物的形成。缺乏内皮细胞的衬被与覆盖,这是导致补片钙化和退变、耐久性差的主要原因之一。Guldner等[8]报道,内皮化处理能明显改善补片钙化,促进新生内膜的形成,增强其组织相容性和使用寿命。因此内皮化对生物补片有重要意义。

修补材料作为外源性的异体植入物,存在潜在的免疫反应和潜在的感染风险。牛心包有其自身的特点,主要由胶原纤维、弹性纤维和多种结缔组织成分组成,含量最多的是胶原,其中又以Ⅰ型胶原为主[9]。胶原作为医疗器械产品最重要的特点在于与其他具有免疫原性的蛋白质相比,它是大分子物质,但结构重复性大,免疫原性较低[10-11]。因此,牛心包片植入体内后不会发生严重的免疫反应。本研究的生化结果显示,两组外周血与炎症免疫有关的白细胞、中性粒细胞计数,INR、肌酐和尿素等指标都无明显增高,欣吉特补片组略小于对照组,差异无统计学意义。除了牛心包有其自身较低的抗原性的特点,商业化的牛心包都予以戊二醛处理,降低了其抗原性。牛心包戊二醛处理后封锁了其抗原性基团抑制免疫排斥反应,减少了血栓形成,降低了感染风险。0.625%戊二醛交联处理不仅可以杀菌,而且可增加生物组织胶原蛋白分子间的交联,掩盖生物组织的抗原部位和中和生物组织表面的正电荷,从而增加生物组织的稳定牢固性,使牛心包机械强度明显提高;同时也去除了大量的可溶性蛋白、黏多糖和糖蛋白、胶原纤维的交联,掩盖和封锁了抗原性基团,抑制免疫排斥反应,减少了血栓形成[12-13]。本实验补片亦用0.625%戊二醛交联处理,可见补片与原组织交界处均有免疫炎性反应,可见到免疫细胞浸润、少量的组织坏死钙化形成。欣吉特牛心包片相对于对照组炎症、坏死程度小,差异无统计学意义。降低生物材料的抗原性,可降低免疫排斥反应、促进补片的内皮化,并减少补片内坏死、钙化的形成,增强补片组织相容性和使用寿命。

然而,人工修补材料缺乏组织重塑、再生和生长,这对于年轻或幼儿患者来说,随着时间的延长将增加再次手术的风险[14]。动物生物材料牛心包、猪心包等,尤其是戊二醛处理过的心包组织在年轻病人中有出现补片的硬化、钙化等改变[15-16]。本研究中的两组牛心包片均有钙化的改变,欣吉特牛心包片相对于对照组钙化程度小,但差异无统计学意义。许多研究报告显示,牛心包补片均出现钙化,采用脱细胞措施或特殊的抗钙化处理后的牛心包组织钙化程度变小,但仍未彻底防止补片钙化[17],因此生物材料钙化机制研究以及抗钙化的处理措施是有待需要解决和改进的重点所在。因此本研究中,实验组欣吉特牛心包补片在其准备过程中,使用射线干性灭菌法减少化学灭菌过程中对组织结构的损害以及化学试剂的毒性作用,从而减少灭菌处理过程可能引起的补片钙化。虽然牛心包作为人工生物材料有其有效性和安全性,但补片钙化、退变问题尚未完全解决,补片内皮化、抗补片钙化和退变是以后人工生物材料使用寿命关键所在。

欣吉特心包补片作为新型国产牛心包补片,在绵羊肺动脉和主动脉补片试验中具有良好的安全性和有效性,不亚于进口的佰仁思牛心包补片,有望解决补片来源问题。

[1] CHOI J,KIM DJ,Kim DJ,etal.Early results of novel bovine pericardial patch using comprehensive anticalcification procedure in a swine model[J].ASAIOJ,2016,62(1):100-105.

[2] SCHOEN FJ,LEVY RJ.Calcification of tissue heart valve substitutes:progress toward understanding and prevention[J].AnnThoracSurg,2005,79(3):1072-1080.

[3] 李勇刚,张尔永.牛心包片在心血管外科的应用[J].华西医学,2002,17(3):420-421.

[4] CHANG Y,LIANG HC,WEI HJ,etal.Tissue regeneration patterns in acellular bovine pericardia implanted in a canine model as a vascular patch[J].JBiomedMaterResA,2004,69(2):323-33.

[5] GULDNER NW,JASMUND I,ZIMMERMANN H,etal.The first self-endothelialized titanium-coated glutaraldehyde-fixed heart valve prosthesis within systemic circulation.[J].JThoracCardiovascSurg,2009,138(1):248-50.

[6] MUTO A,NISHIBE T,DARDIK H,etal.Patches for carotid artery endarterectomy:current materials and prospects[J].JVascSurg,2009,50(1):206-213.

[7] LI X,JADLOWIEC C,GYO Y,etal.Pericardial patch angioplasty heals via an Ephrin-B2 and CD34 positive cell mediated mechanism[J].PLoSOne,2012,7(6):e38844.

[8] GULDNER NW,JASMUND I,ZIMMERMANN H,etal.Detoxification and endothelialization of glutaraldehyde-fixed bovine pericardium with titanium coating:a new technology for cardiovascular tissue engineering[J].Circulation,2009,119(12):1653-1660.

[9] KIM JH,CHO YP,KWON TW,etal.Ten-year comparative analysis of bovine pericardium and autogenous vein for patch angioplasty in patients undergoing carotid endarterectomy[J].AnnVascSurg,2012,26(3):353-358.

[10] REN S,LI X,WEN J,etal.Systematic review of randomized controlled trials of different types of patch materials during carotid endarterectomy [J].PLoSOne,2013,8(1):e55050.

[11] 孙浩峰,梁家立.牛心包在心脏外科中的应用[J].实用心脑肺血管病杂志,2010,18(9):1314-1316.

[12] POK S,JACOT JG.Biomaterials advances in patches for congenital heart defect repair [J].JCardiovascTranslRes,2011,4(5):646-654.

[13] LI X,GUO Y,ZIEGLER K,etal.Current usage and future directions for the bovine pericardial patch[J].AnnVascSurg,2011,25(4):561-568.

[14] NEETHLING WM,STRANGE G,FIRTH L,etal.Evaluation of a tissue-engineered bovine pericardial patch in paediatric patients with congenital cardiac anomalies:initial experience with the ADAPT-treated CardioCel (R) patch[J].InteractCardiovascThoracSurg,2013,17(4):698-702.

[15] MOULTON AL,DE LEVAL MR,MACARTNEY FJ,etal.Rastelli procedure for transposition of the great arteries,ventricular septal defect,and left ventricular outflow tract obstruction.Early and late results in 41 patients (1971 to 1978)[J].BrHeartJ,1981,45(1):20-28.

[16] DOHMEN PM,COSTA FD,LOPES SV,etal.Successful implantation of a decellularized equine pericardial patch into the systemic circulation[J].MedSciMonitBasicRes,2013,20:1-8.

[17] LIM HG,KIM SH,CHOI SY,etal.Anticalcification effects of decellularization,solvent,and detoxification treatment for genipin and glutaraldehyde fixation of bovine pericardium[J].EurJCardiothoracSurg,2012,41(2):383-390.

Safety and effectiveness of domestic bovine pericardium as ovine pulmonary artery and descending aorta patch

MIERADILIJIANG Abudupataer▲, LU Shu-yang▲, CHEN Jin-miao, HE Chen, WANG Chun-sheng, HONG Tao△

(DepartmentofCardiacSurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Objective To evaluate the safety and effectiveness of a newly domestic bovine pericardium using a juvenile sheep model and to provide proof for clinical use. Methods Under the off-pump condition,8 domestic bovine pericardiums were implanted into the pulmonary artery and the descending aorta of 4 juvenile sheep as the trial group.As the control group,four imported bovine pericardiums were implanted into two juvenile sheep．Before the surgery,the juvenile sheep were given a physical examination and some laboratory tests.Ultrasonic cardiographs were taken after 1 month and 2 months of implantation.Sheep were sacrificed after 90 days and compared with the extent of endothelialization,inflammation and calcification of the two groups. Results (1) All the juvenile sheep survived without any complications.(2) Ultrasonic cardiograph showed the absence of leakage,thrombus,calcification,neoplasm or any structural deterioration.(3) Gross examination showed there was no intimal hyperplasia.The thickness and tenacity of all patches had no change compared with the pre-operation condition．All the patches showed smooth and pliable faces without degeneration,as well as absence of macroscopically calcification.(4) There was not any positive result in microbiological tests in both groups.The degree of inflammation,necrosis and calcification had no significant differencs between the two groups. Conclusions The data shows that the domestic bovine pericardium,a newly developed Chinese domestic-design and manufactured bovine pericardium,can exhibit long-term satisfactory safety and efficacy in the implantation of the pulmonary artery and the descending aorta of juvenile sheep.

bovine pericardium; domestic patch; pulmonary artery/sheep; aorta/sheep

国家自然科学基金(81501595)

R654.2

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.02.014

2016-08-15;编辑:沈玲)

▲MIERADILIJIANG Abudupataer and LU Shu-yang contributed equally to this work

△Corresponding author E-mail:hong.tao@zs-hospital.sh.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81501595).