多奈哌齐与左卡尼汀治疗痴呆模型大鼠的疗效比较

申东方 田晓彦 宋荣蓉

(哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科，黑龙江 哈尔滨 150001)

多奈哌齐与左卡尼汀治疗痴呆模型大鼠的疗效比较

申东方 田晓彦1宋荣蓉

(哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科，黑龙江 哈尔滨 150001)

目的 比较左卡尼汀和多奈哌齐对脑室注射链脲佐菌素(STZ)致痴呆大鼠的治疗作用。方法 健康SD雄性大鼠32只，随机分为对照组、模型组、左卡尼汀组、多奈哌齐组(n=8)。模型组和治疗组在手术的第1、3天分别向两侧侧脑室内注射STZ 3 mg/kg，对照组给予相同体积的柠檬酸缓冲液。左卡尼汀组于手术10 d前给予左卡尼汀20 mg·kg-1·d-1灌胃，术后持续90 d，多奈哌齐组给予多奈哌齐0.45 mg·kg-1·d-1灌胃，其余两组给予等量生理盐水。术后第10、90天Morris水迷宫试验，观察大鼠学习记忆能力。术后8 w处死大鼠取海马送电镜观察神经元凋亡情况。结果 术后10 d水迷宫测试，与对照组比较，模型组、左卡尼汀组、多奈哌齐组的潜伏期延长，过平台次数下降(P<0.01)。术后治疗90 d，与模型组比较，多奈哌齐组的潜伏期缩短，过平台次数增加(P<0.01)，左卡尼汀组潜伏期缩短(P<0.05)，过平台次数无明显增加(P>0.05)。左卡尼汀组与多奈哌齐组比较各指标差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，两治疗组电镜下观察大鼠海马细胞结构细胞凋亡程度轻，以多奈哌齐治疗组明显。结论 左卡尼汀与多奈哌齐都能减轻AD模型鼠海马神经元的凋亡，从而起到改善临床症状的作用，左卡尼汀效果不如多奈哌齐。

阿尔茨海默病；左卡尼汀；多奈哌齐；神经元凋亡

预计2050年以后，全球的阿尔茨海默病(AD)患病率将是目前的4倍〔1〕，但其病因迄今不明。抗胆碱酯酶药物是美国食品与药品管理局(FDA)最先批准使用治疗本病的药物，多奈哌齐用于治疗AD病人，已被证明有效，但只能使患者的认知水平下降减轻，却并不能减慢疾病的变性进程。本实验比较左卡尼汀与多奈哌齐对AD大鼠的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SD雄性大鼠32只，2.5～3个月龄，体重200～250 g。由北京通利华实验动物技术有限公司提供。大鼠随机分为对照组、模型组、多奈哌齐组、左卡尼汀组，每组8只。

1.2 主要试剂及仪器设备 左卡尼汀(东北制药总厂)，多奈哌齐(法国PFIZEK·PGM公司)，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，枸橼酸钠溶液(武汉博士德生物工程有限公司)，10%水合氯醛，大鼠立体定位仪(江西医疗器械研究所)，Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)。

1.3 模型制作方法

1.3.1 动物的筛选与分组 在实验前先将大鼠进行水迷宫初筛，测量大鼠对水迷宫学习与记忆的获取能力。通过初筛，去除先天痴呆(潜伏期平均值>50 s)和游泳姿势不良者，将合格大鼠32只随机分为对照组，模型组和多奈哌齐组、左卡尼汀组，每组各8只。

1.3.2 动物模型的制作 水迷宫测试48 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后，参考包新民《大鼠脑立体定向图谱》〔2〕，将大鼠的头固定于立体定位仪上，剪去局部毛发，消毒后沿矢状线切开皮肤，切口长约1.5 cm，将骨膜向两侧推开暴露颅骨，在前囟后1.5 mm、矢状缝侧方1.5 mm处钻孔，微量进样器垂直进入，深度距离脑表面3.5 mm，将STZ溶于柠檬酸缓冲液中(pH4.4)，缓慢注入模型组、多奈哌齐组、左卡尼汀组大鼠。在手术的第1、3天分别向两侧侧脑室内注射，每次每侧注入约10 μl(3 mg/kg)。对照组大鼠脑室内注射相同体积的柠檬酸缓冲液。每侧注入时间为5 min，留针5 min，缓慢出针。无菌骨蜡封闭钻孔，术区滴庆大霉素，缝合消毒。术后大鼠除给予普通饲料及自来水喂养外，牛奶灌胃4 d，青霉素肌注(1次/d，注射5 d)以防止感染。

1.3.3 各组大鼠的处置 多奈哌齐组：大鼠于手术前给予多奈哌齐0.45 mg·kg-1·d-1灌胃10 d，于侧脑室注射STZ术后再持续多奈哌齐灌胃治疗90 d。左卡尼汀组：大鼠于手术前给予左卡尼汀20 mg·kg-1·d-1灌胃10 d，于侧脑室注射STZ术后再持续左卡尼汀灌胃治疗90 d。模型组：大鼠于手术前给予与治疗组等量生理盐水灌胃10 d。于侧脑室注射STZ后再持续生理盐水灌胃持续90 d。对照组：大鼠于手术前给予与治疗组等量生理盐水灌胃10 d。于侧脑室注射与治疗组等量柠檬酸平衡液术后再持续生理盐水灌胃90 d。

1.4 观察指标

1.4.1 大鼠学习记忆能力观察 分别于术后第10、90天进行水迷宫试验，观察大鼠学习记忆能力。

1.4.2 电镜观察 术后90 d处死大鼠取脑海马部位，HE染色及送电镜观察神经元凋亡情况。HE染色：将石蜡切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，二甲苯(Ⅰ)15 min→二甲苯(Ⅱ)15 min→二甲苯(Ⅲ)15 min→100%乙醇10 min→100%乙醇10 min→95%乙醇10 min→90%乙醇10 min→75%乙醇10 min→蒸馏水冲洗两遍→苏木素染色10～15 min→伊红复染→透明、干燥→中性树胶封片。送电镜观察神经元凋亡情况。电镜用固定液(本校电镜室提供)固定过夜，PBS漂洗，丙酮脱水，1%四氧锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅染色，透射电镜下观察。PBS漂洗2次，2.5%的戊二醛固定后送哈尔滨医科大学电镜室观察。

1.5 统计学方法 采用SPSS统计软件包进行t检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠学习记忆能力的变化 术前对照组、模型组、左卡尼汀组、多奈哌齐组的潜伏期及过平台次数无显著差异(P>0.05)。术后第10天，而模型组、左卡尼汀组、多奈哌齐组潜伏期较对照组明显延长(P<0.01)，过平台次数明显减少(P<0.01)。表明STZ侧脑室注射10 d后大鼠认知功能明显下降。术后给予药物治疗90 d，多奈哌齐组、左卡尼汀组与模型组潜伏期差异显著(P<0.01,P<0.05)；左卡尼汀组与多奈哌齐组比较差异显著(P<0.05)，表明多奈哌齐及左卡尼汀组均减短潜伏期，多奈哌齐组更明显。多奈哌齐组过平台次数与模型组差异显著(P<0.01)；左卡尼汀组与模型组无统计学差异(P>0.05)，表明多奈哌齐组增加过平台次数，左卡尼汀组则不明显，表明多奈哌齐治疗改善大鼠认知功能，而左卡尼汀的治疗作用则不如多奈哌齐。见表1，表2。

表1 不同时期大鼠Morris水迷宫试验潜伏期

与对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05；与多奈哌齐组比较：4)P<0.05，下表同

表2 大鼠过平台次数,次)

2.2 组织学改变 ①HE染色：对照组大鼠海马形态完整，神经元数量多，细胞排列整齐，胞内结构正常，染色正常。术后模型组大鼠海马结构异常，神经元细胞明显减少，锥体细胞带紊乱、变稀、中断，可见许多细胞体积缩小，胞核固缩，出现较多凋亡细胞。多奈哌齐、左卡尼汀组较模型组细胞数增多，细胞结构较完整，其中，多奈哌齐组优于左卡尼汀组,见图1。②电镜下细胞学结果：模型组海马细胞皱缩，表面微绒毛消失，线粒体空泡变，核周板层体崩解成髓样变，其他细胞器消失。而多奈哌齐组细胞表面微绒毛较丰富，细胞器结构和膜结构较完整。左卡尼汀组细胞表面绒毛可见，核周体及线粒体明显减少，见图2。

图1 各组海马细胞HE染色(×400)

图2 各组海马细胞学改变(×11 500)

3 讨 论

AD是老年人常见的神经系统变性病，主要表现为持续进行性认知功能障碍而无缓解，其病理特征为老年斑、神经元纤维缠结、海马锥体细胞空泡变性及神经元缺失。随着神经元的缺失，各种神经递质也随之缺乏，其中最早也最明显的是乙酰胆碱。胆碱能受体除与大脑的学习和记忆功能有关外，还与神经保护作用有关〔3〕。这也是目前AD治疗获得有限疗效的重要基础。

多奈哌齐是一种具有高度选择性、可逆性的胆碱酯酶抑制剂，通过抑制胆碱酯酶而抑制乙酰胆碱降解并提高活性，改善神经递质的传递功能。左卡尼汀是哺乳动物能量代谢中需要的内源性物质，在机体能量代谢中必不可少，可促进脂类、葡萄糖以及氨基酸的代谢而改善机体能量供应，其中以促进脂肪的氧化代谢作用最为突出〔4，5〕。左卡尼汀与肌肉细胞、心肌细胞的能量代谢有关，对于各种组织缺血缺氧，左卡尼汀通过增加能量产生而提高组织器官的功能。左卡尼汀在治疗心血管疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、糖尿病并发症、突发性聋、慢性阻塞性肺疾病、减轻肿瘤化疗药物所致神经毒性和血液学毒性等方面取得了较好疗效〔6～8〕。

小剂量STZ侧脑室注射是目前国内外使用较多的制备痴呆动物模型的方法〔9，10〕。本实验结果表明侧脑室注射STZ制造大鼠痴呆模型可靠性好，稳定性高。多奈哌齐治疗改善大鼠认知功能，左卡尼汀治疗疗效果不如多奈哌齐。

左卡尼汀对大鼠认知功能有一定的改善，我们认为这可能与左卡尼汀促进脂类、葡萄糖以及氨基酸的代谢而改善神经元的能量供应，通过增加能量产生而提高神经元细胞的功能，其次，左卡尼汀还是一种优良的抗氧化剂，可增加自由基清除酶活性而对抗氧化应激和炎症反应，保护神经元细胞膜功能，从而对神经元到保护性作用。在本实验中，左卡尼汀有一定的神经元保护作用，但不及多奈哌齐。本实验样本量小，下一步可进行大样本的研究以验证其作用。

1 吴 江.神经病学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2010：331.

2 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定向图谱(Ⅲ)〔M〕.北京：人民出版社，1991：12-8.

3 Dajas-Bailador F，Wonnacott S.Nicotinic acetylcholine receptors and the regulation of neuronal signaling〔J〕.Trends Pharmacol Sci，2004；25：317-24.

4 Ramana KV.Aldose reductase：new insights for an old enzyme〔J〕.Biomol Concepts，2011；2(1-2)：103-14.

6 杜继东.左卡尼汀的临床应用现状〔J〕.天津药学，2013；25(3):548.

7 DiNicolantonio JJ，Lavie CJ，Fares H，etal.L-carnitine in the secondary prevention of cardiovascular disease：systematic review and meta-analysis〔J〕.Mayo Clin Proc，2013；88(6)：544-51.

8 Vidal-Casariego A，Burgos-Peláez R，Martínez-Faedo C.Metabolic effects of L-carnitine on type 2 diabetes mellitus：systematic review and meta-analysis〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes,2013；121(4)：234-8.

9 Nataniel Lester-Coll，Enrique J Rivera.Intracerebral streptozotocin model of type 3 diabetes：relevance to sporadic Alzheimer′s disease〔J〕.J Alzheimer Dis，2006;9(1)：13-33.

10 Lannert H,Hoyer S.Intracerebroventricular administration of streptozotocin causes long-term diminutions in learning and memory abilities and in cerebral energy metabolism in adult rats〔J〕.Behav Neurosci,1998;112(5):1199-208.

〔2015-12-20修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

黑龙江省自然基金资助项目(No.0200869)

宋荣蓉(1965-)，女，博士，主任医师，主要从事阿尔茨海默病、帕金森病的研究。

申东方(1984-)，女，博士在读，主治医师，主要从事阿尔茨海默病、帕金森病的研究。

R749

A

1005-9202(2017)08-1888-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.028

1 哈尔滨医科大学附属第四医院老年病科