解毒祛瘀滋阴方对强的松治疗的MRL/lpr狼疮鼠肺、脾、腹腔巨噬细胞TLR4信号通路的影响

谢冠群 季巾君 范永升

浙江中医药大学基础医学院 杭州 310053

解毒祛瘀滋阴方对强的松治疗的MRL/lpr狼疮鼠肺、脾、腹腔巨噬细胞TLR4信号通路的影响

谢冠群 季巾君 范永升

浙江中医药大学基础医学院 杭州 310053

[目的]观察解毒祛瘀滋阴方对MRL/lpr狼疮鼠巨噬细胞TLR4信号通路的影响。[方法]MRL/lpr狼疮鼠分为模型组、强的松组、解毒祛瘀滋阴方组（以下简称：中药组）以及强的松加中药组(以下简称：中西药结合组)，分别以生理盐水、强的松、解毒祛瘀滋阴方中药和强的松加解毒祛瘀滋阴方中药灌胃4周，收集肺、腹腔、脾脏巨噬细胞，RT-PCR检测相关基因的表达。[结果]经强的松治疗后狼疮鼠肺巨噬细胞TLR4 mRNA和脾巨噬细胞TLR4蛋白都显著升高（P＜0.05），而中西药结合组则可以显著降低升高的脾巨噬细胞TLR4蛋白水平（P＜0.05）。强的松还可以显著降低肺、腹腔巨噬细胞MyD88、IFN-α、iNOS mRNA等TLR4下游分子的表达（P＜0.05），而中西药结合组可以显著升高已经降低的肺巨噬细胞MyD88 mRNA的表达（P＜0.05）。[结论]MRL/lpr狼疮鼠应用糖皮质激素后，巨噬细胞TLR4信号通路发生改变，解毒祛瘀滋阴方中药可以降低糖皮质激素造成的TLR4蛋白的异常表达。

系统性红斑狼疮；MRL/lpr狼疮鼠；巨噬细胞；解毒祛瘀滋阴方；糖皮质激素；副作用；Toll样受体

巨噬细胞是具有防御、调节炎症、诱导免疫等多方面作用的细胞，其主要功能是清除体内衰老损伤或凋亡的细胞以及免疫复合物和病原体等抗原性异物，在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）的发病中具有重要的作用，而且作为固有免疫的重要的组成部分，在抵御入侵的病原微生物中具有重要作用。随着SLE治疗水平的提高，患者因疾病本身的死亡率大大降低，但由于糖皮质激素、免疫抑制剂等造成的感染而导致的死亡却显著上升。Toll样受体（Toll like receptor,TLR）4是识别革兰氏阴性菌细胞壁主要成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）的主要受体，在感染的发病中具有重要作用。中医药在调节患者免疫功能等方面具有很好的疗效，课题组在前期临床研究中发现，解毒祛瘀滋阴方可以减少SLE患者感染的发生[1]，因此希望通过本研究发现解毒祛瘀滋阴方治疗MRL/lpr狼疮鼠减少感染发生的机制。

1 材料与方法

1.1 动物来源 8周龄MRL/lpr狼疮鼠购自中国科学院上海实验动物中心[SCXK（沪）2008-0016]，在浙江中医药大学实验动物中心SPF级封闭状态下饲养[SYXK(浙)2013-0184]，正常饲料自由饮食饮水。

1.2 中药制备 解毒祛瘀滋阴方（升麻9g、青蒿12g、白花蛇舌草15g、赤芍12g、积雪草15g、干地黄15g、炙鳖甲12g、炒薏仁15g、佛手片9g、生甘草6g）药材，由浙江中医药大学中药饮片厂提供。以水500mL煎煮1h，过滤药液，加水500mL，煎煮1h，过滤药液，二次的水煎剂混合后，浓缩成0.6g·mL-1生药。

1.3 主要仪器与试剂 M-MLV逆转录酶（Takara，批号K4707CA），Taq酶（Takara，批号CKA3901C），醋酸泼尼松片（浙江仙居制药，批号151022），TLR4兔抗鼠一抗（Santa sc16240，批号F0520），羊抗兔二抗（Licor 926-68021，批号C40325-02）；引物由上海生工合成；PCR仪（德国，Eppendorf），BIO-RAD凝胶图像分析系统（美国，BIO-RAD）。

1.4 动物分组及处理 按体重随机将24只MRL/lpr狼疮鼠分成4组：模型组、强的松组、解毒祛瘀滋阴方组（以下简称：中药组）以及强的松加中药组(以下简称：中西药结合组）。各组药物剂量以体表面换算成人等效剂量，中药组以0.6g·mL-1生药浓度，每只小鼠灌胃0.5mL；强的松组以0.2mg·mL-1的强尼松灌胃0.5mL；中西药结合组先灌强的松，0.5h后再灌中药，剂量同上；模型组灌0.5mL生理盐水。各组共连续灌胃4周后处死，收集相关标本。

1.5 巨噬细胞提取及培养 肺巨噬细胞制备[2]：MRL/lpr狼疮鼠治疗4周后处死，在75%酒精中浸泡2min，打开颈部皮肤，找出气管，并从口中插入顶端磨平的注射器进入气管，结扎气管，先将肺中气体吸净，再向肺中注入1mL PBS，1min后回吸，重复3次，收集含巨噬细胞的液体。腹腔巨噬细胞制备：肺巨噬细胞收集完成后，向MRL/lpr鼠腹腔中注射PBS 5mL，轻轻按揉小鼠腹部3min，抽取腹腔液，收集含巨噬细胞的液体。脾巨噬细胞制备：腹腔巨噬细胞收集完成后，打开小鼠腹腔，取出脾脏，放入含有PBS的培养皿中，用无菌注射器吸取PBS，将针尖插入脾中反复吹打，直至脾脏呈白色，收集含有脾细胞的液体。将上述3种含巨噬细胞的液体3000r/min离心5min，去上清，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。2h后换液，弃去红细胞、T细胞、B细胞等未贴壁的细胞，剩下的贴壁细胞即巨噬细胞。

1.6 RT-PCR实验方法 收集上述细胞，加入1mL Trizol充分裂解细胞后-80℃保存。RT-PCR检测TLR4、髓样分化因子 88（myeloid differentiation factor88,MyD88）、TIR结构域衔接蛋白（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon,TRIF）、干扰素α（interferon-α,IFN-α）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthesis,iNOS）基因的表达。将上述液体在室温放置10min后加入氯仿混匀，离心后吸取上清，加入等体积异丙醇，-20℃静置30min后离心去上清，加入无水乙醇洗涤后晾干得到RNA，测定浓度后加入等量RNA进行cDNA逆转录及PCR目的基因扩增。各引物序列（表1），PCR扩增结束后，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，拍照记录结果。通过软件计算各组的灰度值，与Actin比较，得出各基因mRNA的相对表达量。

表1 各基因引物序列Tab.1 The genetic sequences of primers

1.7 Western Blot实验方法 收集脾脏巨噬细胞，加入细胞裂解液充分裂解，离心后取上清待用。配置SDS-PAGE，将上述样品煮沸后加样电泳，转膜，脱脂奶粉封闭后一抗孵育过夜，二抗孵育2h后扫膜仪进行扫描拍照。

2 结果

2.1 巨噬细胞形态观察 巨噬细胞1～2h开始贴壁，呈扁圆形，5～6h后逐渐伸出伪足，呈三角形或多边形。24h后台盼蓝染色结果显示，巨噬细胞成活率＞95%。

2.2 肺、腹腔、脾巨噬细胞TLR4信号通路相关mRNA表达的变化 收集各组巨噬细胞，RT-PCR结果显示：与模型组比较，强的松组小鼠的肺巨噬细胞TLR4 mRNA显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），脾和腹腔的巨噬细胞有升高趋势，中药组有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与强的松组比较，肺、脾、腹腔的中西药结合组都有一定程度的下降，差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，强的松组、中西药结合组的3种巨噬细胞MyD88 mRNA显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），强的松组的肺、腹腔巨噬细胞IFN-α mRNA显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。与强的松组比较，中西药结合组肺巨噬细胞MyD88 mRNA显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），其余指标变化不明显。详见表2～4。

2.3 脾巨噬细胞TLR4蛋白的表达变化 收集各组小鼠脾巨噬细胞，Western blot实验结果显示：与模型组比较，中药组TLR4的表达显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），强的松组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与强的松组比较，中西药结合组显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

表2 药物对MRL/lpr鼠肺巨噬细胞TLR4信号通路相关基因mRNA表达的影响（±s）Tab.2 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in lung macrophages of MRL/lpr mice（±s）

表2 药物对MRL/lpr鼠肺巨噬细胞TLR4信号通路相关基因mRNA表达的影响（±s）Tab.2 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in lung macrophages of MRL/lpr mice（±s）

注：与模型组比较，▲P＜0.05；与强的松组比较，◇P＜0.05。Note:Compared with model group,▲P＜0.05;compared with prednisone group,◇P＜0.05.

模型组 中药组 强的松组 中西药结合组TLR4 MyD88 TRIF IFN-α IFN-β iNOS 1.19±0.32 0.43±0.10 0.61±0.16 0.56±0.17 0.67±0.17 0.55±0.09 1.06±0.31 0.31±0.05▲0.76±0.24 0.48±0.13 0.60±0.19 0.48±0.11 2.04±0.50▲0.24±0.07▲0.64±0.16 0.35±0.10▲0.56±0.18 0.38±0.12▲1.82±0.44 0.33±0.08▲◇0.67±0.13 0.41±0.10 0.68±0.09 0.34±0.08▲

表3 药物对MRL/lpr鼠脾巨噬细胞TLR4信号通路相关基因mRNA表达的影响（±s）Tab.3 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in splenic macrophages of MRL/lpr mice（±s）

表3 药物对MRL/lpr鼠脾巨噬细胞TLR4信号通路相关基因mRNA表达的影响（±s）Tab.3 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in splenic macrophages of MRL/lpr mice（±s）

注：与模型组比较，▲P＜0.05。Note:Compared with model group,▲P＜0.05.

模型组 中药组 强的松组 中西药结合组TLR4 MyD88 TRIF IFN-α IFN-β iNOS 1.43±0.49 0.29±0.02 0.70±0.20 0.44±0.10 0.65±0.19 0.38±0.11 1.07±0.28 0.23±0.04 0.67±0.11 0.42±0.12 0.44±0.09 0.37±0.11 2.21±0.90 0.19±0.02▲0.59±0.14 0.32±0.09 0.49±0.11 0.28±0.05 1.93±0.76 0.21±0.04▲0.64±0.11 0.33±0.07 0.52±0.06 0.28±0.06

3 讨论

SLE的发病机制非常复杂，而治疗多以免疫抑制剂为主，虽然疾病得以控制，但感染等副作用凸显，导致近年来疾病的死亡原因发生了很大的变化，疾病本身导致的死亡大大减少，而感染及药物副作用导致的心血管疾病成为死亡的主因。课题组统计了12篇有关SLE死因分析及感染分析的文献共涉及患者4653 例[3-14]，其中发生感染1872例，其中革兰氏阴性细菌感染337例，革兰氏阳性细菌感染202例，未区分种类346例，真菌434例，病毒384例，由以上结果可以发现，细菌感染占SLE所有感染的47.3%，因此课题组认为细菌感染，尤其是革兰氏阴性菌的感染是SLE感染的主要因素。课题组之前的研究发现，糖皮质激素可以抑制巨噬细胞的吞噬功能，而解毒祛瘀滋阴方可以缓解糖皮质激素的作用[15]。因此，课题组进一步研究了解毒祛瘀滋阴方减少糖皮质激素副作用的作用机制。

表4 药物对MRL/lpr鼠腹腔巨噬细胞TLR4信号通路相关基因mRNA表达的影响（±s）Tab.4 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in peritoneal macrophages of MRL/lpr mice（±s）

表4 药物对MRL/lpr鼠腹腔巨噬细胞TLR4信号通路相关基因mRNA表达的影响（±s）Tab.4 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in peritoneal macrophages of MRL/lpr mice（±s）

注：与模型组比较，▲P＜0.05。Note:Compared with model group,▲P＜0.05.

模型组 中药组 强的松组 中西药结合组TLR4 MyD88 TRIF IFN-α IFN-β iNOS 1.81±0.73 0.31±0.05 0.88±0.34 0.58±0.14 0.66±0.12 0.37±0.08 1.36±0.41 0.20±0.03▲0.51±0.17▲0.42±0.11 0.47±0.10 0.31±0.08 2.54±0.67 0.15±0.03▲0.69±0.14 0.36±0.09▲0.46±0.07 0.22±0.06▲2.17±0.52 0.17±0.02▲0.74±0.18 0.36±0.13▲0.44±0.05▲0.17±0.05▲

图1 各组脾巨噬细胞TLR4蛋白电泳图（A）及其统计（B）Fig.1 The electrophoretogram of TLR4 protein expression in splenic macrophages in each group(A)and its statistical graph(B).

TLR4主要识别革兰氏阴性菌的LPS、革兰氏阳性菌的磷壁酸和热休克蛋白60等，因此TLR4与细菌等感染密切相关。未经治疗的初发SLE患者的外周血细胞TLR4 mRNA水平显著升高[16]，而稳定期的SLE患者合并感染与不合并感染者外周血单个核细胞的TLR4的阳性率没有差异，活动期SLE患者合并感染及不合并感染者PBMC的TLR4的阳性率也没有差异[17]，而正常情况下伴有细菌感染特别是革兰氏阴性菌感染的患者TLR4的表达都有一定程度的升高。应用糖皮质激素、硫唑嘌呤、环磷酰胺、来氟米特、甲氨蝶呤、霉酚酸酯等免疫抑制剂的自身免疫病患者（包括SLE、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、干燥综合症等），有TLR4表达升高的现象[18]，说明TLR4的异常不仅与糖皮质激素等免疫抑制剂的治疗有关，而且与疾病也有密切关系。这些患者的外周血单个核细胞经TLR1/2/4/5/6配体的刺激后，IL-8和TNF-α的分泌比正常组显著升高，因此自身免疫病患者应用免疫抑制剂后，其固有免疫反应不是减弱而是增强。但这些患者更容易发生感染，原因并非固有免疫被抑制，而是功能失调，同时这可能与TLR4相关信号通路异常有关。因此，TLR4信号通路的异常与SLE的发病、免疫抑制剂的副作用都有密切关系。

解毒祛瘀滋阴方在之前的临床研究中发现，可以减少糖皮质激素导致的SLE患者感染的发生[1]，细胞实验发现解毒祛瘀滋阴方可以减轻糖皮质激素抑制巨噬细胞吞噬细菌的作用，故本研究希望通过MRL/lpr狼疮鼠动物模型进一步明确解毒祛瘀滋阴方减轻糖皮质激素导致的感染副作用的机制。MRL/ lpr狼疮鼠应用糖皮质激素之后，TLR4 mRNA的表达升高与文献报道一致，糖皮质激素结合解毒祛瘀滋阴方治疗后TLR4 mRNA的表达有不同程度的降低，脾巨噬细胞TLR4蛋白的表达也降低，表明中药可以调控糖皮质激素造成的TLR4 mRNA和蛋白的异常表达。由于肺、腹腔巨噬细胞含量较少，因此只检测脾TLR4蛋白的表达。课题组推测因为糖皮质激素具有免疫抑制作用，可以降低巨噬细胞的吞噬作用，而TLR4是识别革兰氏阴性菌细胞膜上的LPS的受体，机体通过升高TLR4的表达以降低机体感染的风险，这相当于机体在糖皮质激素作用下的负反馈调节。同时TLR4下游信号通路亦被抑制，如MyD88、TRIF以及发挥激活炎症反应的效应分子IFN-α、IFN-β、iNOS也都有不同程度的降低，这可能就是糖皮质激素导致感染发生的原因之一。糖皮质激素合用中药后，TLR4的表达不同程度的降低，而其下游分子未见进一步下降，可见中药可以恢复糖皮质激素对TLR4分子的异常调控，但未进一步抑制其下游信号分子，导致免疫抑制进一步加重。综上所述，应用糖皮质激素后，MRL/lpr狼疮鼠免疫受到抑制，TLR4信号通路发生异常，而合用解毒祛瘀滋阴方中药后TLR4蛋白的异常表达得到缓解，而其下游的信号分子未进一步恶化，这可能就是中药减轻糖皮质激素造成感染副作用的作用机制。

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Effects of Jiedu Quyu Ziyin Decoction on TLR4 Signal Pathway in Lung,Spleen and Peritoneal Macrophagocyte of MRL/lpr Lupus Mice Treated by Prednisone

XIE Guanqun,JI Jinjun,FAN Yongsheng College of Basic Medical Sciences,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)China

[Objective]To observe the effect of Jiedu Quyu Ziyin decoction on TLR4 signaling pathway in macrophages of MRL/lpr lupus mice.[Method]MRL/ lpr lupus mice were divided into four groups:model group,prednisone group,Jiedu Quyu Ziyin decoction group(hereinafter referred to as:Chinese medicine group)and prednisone plus Chinese medicine group(hereinafter referred to as:combination of Chinese and western medicine group).The mice were gavaged with saline,prednisone,Jiedu Quyu Ziyin decoction and prednisone added Jiedu Quyu Ziyin decoction for 4 weeks.Macrophages of lung,peritoneal and spleen were collected and the expression of related genes was detected by RT-PCR.[Result]TLR4 mRNA in lung macrophages,and TLR4 protein in splenic macrophages increased significantly(P＜0.05)after the treatment of prednisone.The increased TLR4 protein in splenic macrophages was significantly decreased by combining with Jiedu Quyu Ziyin decoction(P＜0.05).Prednisone can significantly reduce the TLR4 downstream molecules such as MyD88, IFN-α,iNOS mRNA expression in lung and peritoneal macrophages(P＜0.05).The decreased MyD88 mRNA in lung macrophages was increased significantly by combining with Jiedu Quyu Ziyin decoction(P＜0.05).[Conclusion]TLR4 signaling pathway is changed in macrophages after glucocorticoid administration in MRL/lpr lupus mice.Jiedu Quyu Ziyin decoction can reduce the abnormal glucocorticoid-induced TLR4 protein expression.

systemic lupus erythematosus;MRL/lpr lupus mice;macrophagocyte;Jiedu Quyu Ziyin decoction;glucocorticoid;side effect;Toll-like receptor

R331

A

1005-5509（2017）04-0318-05

10.16466/j.issn1005-5509.2017.04.016

2016-11-25）

国家自然科学基金（81403289）；浙江省自然科学基金（LQ14H270003）；浙江省教育厅科研项目（Y201327513）；浙江中医药大学校级课题（2012ZR01）；浙江中医药大学基础医学院院级科研基金

Fund projects:NationalNaturalScience Foundation ofChina(81403289);NaturalScience Foundation ofZhejiang Province(LQ14H270003);Scientific Research Projects of Zhejiang Province Education Department(Y201327513);Science Foundation of Zhejiang Chinese Medical University(2012ZR01);Science Foundation of College of Basic Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

范永升，E-mail：fyszjtcm@163.com