新疆小拟南芥NAC转录因子ApNAC055的克隆及表达分析

林军，张亮，黄先忠

（石河子大学生命科学学院特色植物基因组学实验室，新疆 石河子 832003）

极端温度、干旱和高盐碱等不利的环境条件，会严重影响植物的生长发育，甚至会造成植物死亡。植物面对不利的环境时，诱导许多抗逆相关基因表达[1]，而转录因子在植物基因调控中发挥着重要作用——激活或抑制靶基因的表达[2]。NAC(NAM、ATAF1/2、CUC1/2)转录因子是近年来发现的一类植物特有、数量最多的转录因子家族之一[3]，成员广泛分布于陆生植物中，其及相应的顺式作用元件在调节基因时间和空间的表达起分子开关的作用[4]。目前已有较多研究表明，NAC转录因子具有诸多方面的功能，如参与植物次生生长，在细胞分裂和植株衰老中发挥作用，参与激素调控和信号转导，参与矿质元素营养和农作物品质改良等，同时，NAC转录因子还参与生物胁迫中植物的防御反应以及在非生物逆境中发挥作用。

NAC转录因子具有显著的结构特点，蛋白N端含有1个高度保守的NAC结构域，约有150个氨基酸，1共包含了5个保守的亚结构域—A、B、C、D和E[5]。亚域A、C和D高度保守，亚域B和E较为多变，亚域E可能参与发育时期调控和（或）组织特异性，并协同亚域D与DNA发生相互作用[6-7]，这可能是NAC基于功能多样性的原因之一。NAC蛋白的C末端区域是高度多样化的，并赋予转录激活调控的多样性。

目前，有研究已证明多个NAC转录因子涉及植物抗逆过程，在植物非生物逆境中发挥重要作用。如拟南芥中AtAF1可响应干旱胁迫，干旱和脱落酸(ABA)处理后表达量均增加，但会受水淹的抑制[8]；拟南芥NTL8是与膜相连的NAC转录因子，盐胁迫诱导下才能生成活性形式，且可通过调控FT基因的表达在开花期调节盐胁迫[9]；水稻中的OsNAC6受到寒冷、盐、干旱、ABA、机械损伤、茉莉酸和突发性疾病的诱导，过表达OsNAC6可诱导许多非生物胁迫相关基因的表达[10]；拟南芥中 ANAC019、ANAC055和ANAC072均可受干旱、高盐以及ABA等逆境胁迫诱导表达，且过表达这3个基因均可提高植株的耐旱能力[11]；而小麦中的TaNAC4则可被高盐、伤害和低温等条件刺激诱导[12]。

小拟南芥(Arabidopsis pumila)是一种在新疆分布广泛的十字花科早春短命植物，在《新疆植物志》第三卷中被命名为鼠耳芥，俗称小拟南芥，Al-Shehbaz于1999年归其为Olimarabidopsis pumila(无苞芥属)，因此也可称其为无苞芥(Olimarabidopsis pumila)。它是拟南芥的近缘种，具有光合速率强、繁殖率高、结实量大等特点，且有一定表型可塑性，且与拟南芥相比，小拟南芥更为耐受NaCl胁迫[13-14]，这些特点均使得小拟南芥可更好地在新疆特殊的高盐碱环境下生存。近年来本实验室已经从小拟南芥克隆了一些抗逆相关基因，比如OpNHX1[15-16]、OpVP1[17]、OpZFP[18]、OpNAC026、OpNAC083[19-20]以及 OpDBR[21]。据调查研究，ApNAC055在拟南芥中的同源基因ANAC055的表达能够由干旱，高盐度以及脱落酸诱导，转基因拟南芥中的基因表达活性结果显示，ANAC055的表达主要定位在叶片中，且转基因植物中几种胁迫诱导型基因均显示表达上调，植株表现出显著增加的耐旱性，表明ANAC055很可能在拟南芥非生物胁迫响应应答方面起着重要作用[22]。本研究从小拟南芥中克隆了ApNAC055，对其进行生物信息学分析以及在盐胁迫处理下表达模式的分析，以期为该基因后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

小拟南芥(Arabidopsis pumila)种子为本实验室保存。小拟南芥种子灭菌和植株室内的培养参照文献[15]中的方法。

1.2 方法

1.2.1 小拟南芥总RNA提取及cDNA合成

采用的Tiangen公司的RNA prep pure Plant Kit试剂盒提取小拟南芥叶片总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测质量完好的RNA置于-80℃保存备用。根据说明书，利用北京百泰克公司M-MLV Reverse Transcriptase合成cDNA模板第一链。

1.2.2 小拟南芥ApNAC055 CDS区的克隆与测序

根据小拟南芥盐胁迫转录组数据，发现1条Unigene与拟南芥NAC转录因子AtNAC055序列相似性极高，利用DNAStar软件分析该序列的完整开放阅读框 (ORF)。根据该ORF设计引物ApNAC055-F和ApNAC055-R，在两端分别加上Xba I和Sma I酶切位点(表1)，以小拟南芥叶片cDNA为模板进行RT-PCR扩增，使用18S rRNA基因作为参照基因，PCR体系参照Ex Taq(TaKaRa)说明书。反应程序为94℃预变性4 min，94℃变性 45 s，60 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸1 m，35个循环后，72℃延伸10 min。将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测(表1)，在紫外灯下切下凝胶中的目的基因条带，按照凝胶回收试剂盒说明书进行PCR产物的回收，连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行酶切验证，将鉴定正确的菌液送往北京六合华大基因有限公司进行测序。

表1 研究所用的PCR引物序列Tab.1 PCR primers used in this study

1.2.3 小拟南芥ApNAC055 CDS区的生物信息学分析

蛋白质氨基酸组成、相对分子质量、等电点、疏水性等理化性质的分析利用ExPASy网站ProtParam工 具(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)进 行[24]。利用DNAMAN软件预测基因的最大开放阅读框(ORF)及其编码蛋白的氨基酸序列。利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析该蛋白的跨膜区；蛋白的二级结构利用SOPMA软件分析，蛋白的三级结构通过Swiss model(http://swissmodel.expasy.org/)软件预测。利用NCBI的Blastp程序检索ApNAC055的同源蛋白，氨基酸序列的多重比对采用Clustal X 2.0程序完成，用MEGA 5.0软件构建系统进化树，其中用Neighbor-Joining方法进行1000次 Boot-strap分析[25]。

1.2.4 小拟南芥ApNAC055的表达分析

将培养2周的小拟南芥幼苗转移至含200 mmol/L NaCl的1/2 MS固体培养基上分别处理0、3、6、12、24 和 48 h；收集成熟小拟南芥植株根、茎、叶、花以及果荚。根据“1.2.2”的方法提取样品总RNA以及cDNA模板的合成，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术进行基因的组织表达和胁迫表达分析。ApNAC055 ORF引物为ApNAC055-RT-F和ApNAC055-RT-R，组织表达分析选择转录起始因子1(Transcription initiation fator，HAF1)作为内参引物：HAF1-F和HAF1-R(表1)；盐胁迫表达分析选择延伸因子1-α (Elongation fator 1-alpha，EF1-α)作为内参引物：EF1-α-F和 EF1-α-R(表 1)。qRT-PCR采用Fast SYBR Mixture试剂盒(康为世纪)，利用美国ABI7500Fast实时荧光定量PCR仪(Life Technologies，Foster City，CA，USA) 进行扩增。在 10 μL的反应体系中加入 cDNA模板 2μL，Ultra SYBR Mixture 5 μL，ROX 0.2 μL，正反向引物(10 μmol/L)各 0.2 μL，RNase-Free Water 补齐。反应程序为95℃预变性 10 min，95℃变性 15 s，60℃退火1 min，40个循环，60℃读取荧光值。检测每份样品的目的基因和内参基因的Ct值，每份样品3次PCR重复。实验数据采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析[17]，分别将根和盐胁迫处理0 h的mRNA水平设定为标准值1，使用Microsoft Excel 2010软件处理数据并作图。

2 结果与分析

2.1 小拟南芥ApNAC055 CDS区的克隆与分析

为了获得新疆小拟南芥的ApNAC055基因的ORF，以叶片cDNA为模板，通过RT-PCR技术扩增出了该基因的CDS，产物大小约为1000 bp(图1)。测序结果结合转录组数据，表明ApNAC055全长为1246 bp，ORF实际大小为 954 bp，推测编码 317个氨基酸(图 2)。

图1 ApNAC055基因的扩增Fig.1 Amplification of ApNAC055

图2 ApNAC055核苷酸序列及推测氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of ApNAC055 and the deduced amino acid sequence

2.2 ApNAC055CDS区的生物信息学分析

ApNAC055编码蛋白的理化性质分析结果表明，该蛋白的分子式为C1583H2415N443O475S6，分子量35444.63 Da，等电点为8.86，属于稳定蛋白。亲疏水性预测表明，总平均亲水性为-0.632，亲水性越强氨基酸分值越低，疏水性越强分值越高，因此，小拟南芥ApNAC055是亲水性蛋白。跨膜结构分析结果表明ApNAC055蛋白无明显的跨膜结构域，因此ApNAC055可能不是膜蛋白。

利用NCBI网站保守结构域分析工具(Conserved domain database，CDD)对ApNAC055蛋白进行保守结构域分析，结果表明，ApNAC055属于NAM亚家族，具有典型的NAM结构(图3)。其中NAC域位于第14到第162个氨基酸，包含1个DNA结合域和1个二聚化域，DNA结合域处于滴102位氨基酸到168位氨基酸。亚细胞定位预测其为细胞核定位。

SPOMA预测的ApNAC055蛋白二级结构 (图4)表明共有α-螺旋(Alpha helix)73处，占二级结构的23.03%；延伸链(Extended strand)64处，占二级结构的20.19%，β-转角(Beta turn)33处，占二级结构的10.41%；无规卷曲结构(Random coil)147处，占二级结构的46.37%。Swiss-model同源建模软件分析其对应的三级结构(图5)，结果表明该蛋白与拟南芥的三级结构相似性为94.05%。

图3 ApNAC055蛋白保守结构域分析Fig.3 The conserved domain of ApNAC055 protein

图4 ApNAC055蛋白的二级结构预测Fig.4 Secondary structure prediction of ApNAC055

图5 ApNAC055蛋白的三级结构预测Fig.5 Third structure prediction of ApNAC055

利用Blastp检索ApNAC055的同源蛋白，选取其它5个物种的NAC055蛋白氨基酸序列，包括拟南芥 (Arabidopsis thaliana，NP_188169.1)、琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata，XP_002882947.1)、亚麻芥(Camelinasativa，XP_010487376.1)、萝 卜 (Raphanussativus，XP_018486947.1)和欧洲油菜(Brassica napus，NP_001303168.1)。经 Clusta lX 2.0 比对(图 6)发现，NAC 蛋白N端均存在1段约150个氨基酸残基组成的保守域，即NAC结构域，其存在5个亚结构域—A、B、C、D和E，我们可以发现它们是极度保守的，一致性很高；而蛋白C端则很明显开始出现多样化，并且小拟南芥、拟南芥以及琴叶拟南芥三者与萝卜和欧洲油菜NAC055相比，在第278个氨基酸开始，出现了约15个氨基酸片段的缺失，很有可能造成NAC055基因在前三者与萝卜以及欧洲油菜中功能出现差异。

图6 小拟南芥ApNAC055同其他物种NAC055蛋白氨基酸序列的多重比对Fig.6 Amino acid alignment of ApNAC055 with other NAC055 from different plant species

2.3 ApNAC055蛋白的系统进化分析

通过NCBI数据库检索ApNAC055的同源蛋白序列，利用MEGA 5.0软件构建了小拟南芥(Arabidopsis pumila)ApNAC055与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、琴叶拟南芥 (Arabidopsis lyrata)、亚麻芥(Camelinasatinus)、 荠 菜 (Capsellarubella)、 芜 菁(Brassica rapa)、欧洲油菜(Brassica napus)以及甜橙(Citrus sinensis)中NAC转录因子蛋白的系统进化树(图 7)。结果(图 7)表明，ApNAC055 与芥属的 NAC055蛋白进化关系均较近，与芜菁BrNAC055的亲缘关系最近，属于同一进化分支，与甜橙CsNAC055亲缘关系较远。

图7 ApNAC55与其他植物NAC家族转录因子蛋白序列进化分析Fig.7 Phylogenetic tree of ApNAC055 and other NAC family transcription factor proteins from other plant species based on amino acid sequences

2.4 基因的组织表达分析与胁迫表达分析

qRT-PCR实验结果(图8)表明，ApNAC055在小拟南芥各组织中均有表达，但在花和果荚中的表达量最高，尤其是在果荚中。盐胁迫表达分析结果(图9)显示ApNAC055积极响应盐胁迫应答，并在后续时段中持续保持高表达水平。

图8 小拟南芥ApNAC055组织表达情况Fig.8 Expression patterns of ApNAC055 in different tissues ofArabidopsis pumila

图9 200 mmol/L NaCl处理下小拟南芥幼苗ApNAC055的表达情况Fig.9 Expression patterns of ApNAC055 under 200 mmol/L NaCl stress inArabidopsis pumilaseedlings

3 讨论

NAC转录因子在植物非生物胁迫应答过程中起着重要作用，但目前对其分子机制还不明确，因此分析其功能机制十分重要。本研究以小拟南芥ApNAC055为研究对象，利用了高盐胁迫小拟南芥转录组数据，从小拟南芥叶片cDNA中克隆了该基因CDS区。ApNAC055蛋白在N端存在1个NAM保守域，保守域上存在5个亚结构域，而在蛋白C端结构较为不保守，其结构表明ApNAC055很可能在功能上存在着多样性。

基因表达模式的分析对于功能研究是必不可少的，组织表达分析表明ApNAC055在小拟南芥各组织中表达幅度较大，主要在叶片和果荚中表达量较高，尤其是在果荚中，表达量几近达到根、茎和叶中的20倍，说明ApNAC055很可能参与到小拟南芥花器官和(或)种子的形成和发育的过程；本研究使用200mmol/LNaCl胁迫处理表达分析结果显示ApNAC055能够明显且快速地被诱导表达，且持续保持着较高的表达水平，表明ApNAC055很可能参与小拟南芥盐胁迫响应。

已有研究表明，拟南芥AtNAC055基因在拟南芥耐旱过程起着重要作用，过表达AtNAC055植株存在着较强的抗旱性，并且能够被ABA、盐和干旱显著诱导表达[26]。本研究也证实了在小拟南芥中ApNAC055基因很可能参与盐胁迫响应应答。对于在小拟南芥其他非生物胁迫响应过程中是否发挥作用的深入研究将是今后要展开的工作，以进一步研究ApNAC055的生物学功能。

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