百里香精油和多抗霉素对马铃薯立枯丝核菌病原菌的抑制作用研究

张阿强+田永强+刘震飞+潘彦彪

摘要：为了研究百里香精油和多抗霉素对马铃薯立枯丝核菌的抑制效果，采用菌丝生长速率抑制法，测试了百里香精油和多抗霉素对马铃薯立枯丝核菌菌丝的抑制效果，并研究了两者的协同抑菌作用。结果表明：百里香精油和多抗霉素均可有效抑制马铃薯立枯丝核菌，两者最小抑菌浓度MIC分别为0.6422微升/毫升、0.9393微升/毫升，且两者表现出明显的协同抑菌效果，为生物制剂的开发提供了依据。

关键词：百里香精油；多抗霉素；协同作用；抗真菌活性；立枯丝核菌

中图分类号： TS201.3 献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.08.030

传统农药在农业作物病虫害预防与防治、保证农作物稳定高产方面发挥了重要作用。但是，随着人们长期大量使用抗生素类农药，病原菌产生抗药性问题日益受到广泛关注[1，2]。因而针对植物病害的植物源农药的研究与开发成为当今农药研究领域的一个热点[3-5]。百里香精油作为其中一种高效的植物源抑菌药物，受到广大科研工作者的青睐。百里香精油已被证明具有广谱的抑菌性能，可以有效抑制食品上的曲霉与李斯特菌，伤口上包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在内的细菌[6-8]。

马铃薯立枯丝核菌病，又称黑痣病、茎溃疡病、茎基腐病、黑色粗皮病，是通过带病种薯和土壤传播的。随着马铃薯产业的迅猛发展，该病的发病率逐年升高，目前已成为阻碍马铃薯产业健康发展的主要病害之一。该病害的病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），可以侵染不同器官，引起多种症状，严重影响产品的商品性和贮藏性[9-11]。

本文以马铃薯立枯丝核菌菌为供试菌株，测试了在体外条件下百里香精油及多抗霉素对马铃薯立枯丝核菌菌丝生长的抑制效果，并研究了百里香精油与多抗霉素的协同抑菌作用。

1 材料与方法

1.1材料仪器

供试菌株：马铃薯立枯丝核病菌（Rhizoctonia solani）菌种，由本实验室保存。

试剂：无水乙醇、葡萄糖、Tween-80均为国产分析纯，百里香精油购自江西华美香料。

仪器设备：电子天秤（YP102N 上海精科仪器）、超净工作台（SW-CJ-2D 苏州净化）、立式高压蒸汽灭菌锅（LDZX-50F 上海申安）、培养箱（MJ-250-I 上海一恒）、分析天平（FA1204B 上海精科仪器）。

1.2方法

1.2.1培养基与药品准备 PDA培养基：200克土豆去皮、切块煮烂后，纱布过滤，加入20克葡萄糖、16克琼脂，1000毫升蒸馏水，pH值自然。

100倍百里香精油配制：以无水乙醇为溶剂，将百里香精油分别稀释为10μL/mL、20μL/mL、30μL/mL，同时向其中添加20μL/mL的吐温-80，经20μm膜过滤除菌后备用。

100倍多抗霉素配制：用蒸馏水将多抗霉素分别配制成10mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL的溶液，经20μm膜过滤除菌后备用。

1.2.2菌种活化 在无菌条件下，从保藏的斜面菌种中挑取马铃薯立枯丝核菌菌块，接入PDA培养基平板上。28℃培养120小时，备用。

1.2.3百里香精油抑菌活力测定 经121℃高温蒸汽灭菌20分钟的PDA培养基，在超净工作台上冷却至55℃左右时，按100毫升培养基添加1毫升100倍百里香精油的量，分别添加不同浓度的百里香精油。轻轻摇匀后倒入90毫米的培养皿中，制成含不同浓度百里香精油的平板。再用灭菌的5毫米打孔器在上述活化的马铃薯立枯丝核菌平板上打取菌饼，用镊子将菌柄分别倒贴于含不同浓度百里香精油的平板上，对照组使用等体积的无水乙醇代替精油。置于培养箱28℃培养，并分别在72小时、96小时和120小时按十字交叉法测量菌落直径。

1.2.4多抗霉素抑菌活力测定 经121℃高温蒸汽灭菌20分钟的PDA培养基，在超净工作台上冷却至55℃左右时，按100毫升培养基添加1毫升100多抗霉素的量，分别添加不同浓度的多抗霉素。轻轻摇匀后倒入90毫米的培养皿中，制成含不同多抗霉素的平板。用灭菌的5毫米打孔器在马铃薯立枯丝核菌平板上打取菌餅，然后用镊子将菌饼分别倒贴于含不同浓度多抗霉素的平板上，对照组使用等体积的无菌水代替多抗霉素。置于培养箱28℃培养，并分别在72小时、96小时和120小时按十字交叉法测量菌落直径[12]。

1.2.5百里香精油与多抗霉素协同作用测定 经121℃高温蒸汽灭菌20分钟的PDA培养基，在超净工作台上冷却至55℃左右时，按100毫升培养基添加1毫升浓度为20 mg/mL的多抗霉素。然后再分别加入1毫升浓度为10μL/mL、20μL/mL、30μL/mL的百里香精油。轻轻摇匀后倒入90毫米的培养皿中，制成含0.2mg/mL多抗霉素的平板及不同浓度的百里香精油的平板。用灭菌的5毫米打孔器在马铃薯立枯丝核菌平板上打取菌饼，然后用镊子将菌饼分别倒贴于平板上，对照组用等体积的无菌水和无水乙醇代替多抗霉素和百里香精油。置于培养箱28℃培养，并分别在72小时、96时小时和120小时按十字交叉法测量菌落直径。

1.2.6数据分析 菌丝生长抑菌率按如下公式计算：

菌落增长直径=菌落直径-接种菌饼直径

测量结果利用origin8.5软件绘制标准曲线，求出毒力方程、相关系数、MIC、EC50[12]。

2结果与分析

2.1百里香精油对马铃薯立枯丝核病原菌菌丝生长的抑制活性

由图1可以看出，百里香精油随着浓度的增大其抑菌效果逐渐增加，在浓度为0.4 μL/mL时，抑菌率达到100%。在百里香精油浓度大于0.2 μL/mL时，对马铃薯立枯丝核病原菌有显著的抑制作用。在浓度为0.1 μL/mL至0.3 μL/mL时，抑菌效果由快变缓，在浓度大于0.3 μL/mL时，抑菌效果由缓变快。抑菌效果随着时间呈延长下降趋势，在百里香精油的浓度为0.4 μL/mL时，三个时间点的抑菌浓度为100%，无变化。利用试验数据进行统计分析，在72小时的毒力方程为：Y=1.2775x+0.1796，r=0.9649，得出百里香精油对马铃薯立枯丝核病原菌的EC50为0.2509 μL/mL，MIC为0.6422 μL/mL。

2.2多抗霉素对马铃薯立枯丝核病原菌菌丝生长的抑制活性

由图2可以看出，在浓度为1.0 mg/mL时，抑菌率达到最大值，为100%。在浓度大于0.5 mg/mL时抑菌效果由快变缓。抑菌效果随着时间的延长呈明显的下降趋势，在百里香精油的浓度为1.0 mg/mL时，三个时间检测点的抑菌浓度接近100%，没有明显的变化。利用试验数据进行统计分析，在72小时时的曲线毒力方程为Y=0.9177x+0.1380，r=0.9416，计算结果表明多抗霉素对马铃薯立枯丝核病原菌的EC50为0.3944 mg/mL，MIC为0.9393 mg/mL。

2.3百里香精油和多抗霉素对马铃薯立枯丝核病原菌菌丝生长的协同抑制活性

马铃薯立枯丝核在百里香精油浓度为0.05 μL/mL时培养观察120小时的抑菌率为20.76%，多抗霉素浓度为0.1 mg/mL时，培养120小时时的抑菌率为7.27%，两者的抑菌率均小于10%，但是百里香精油和多抗霉素在此浓度下的协同抑菌效果到了93.22%，表现出显著的协同抑菌效果。

3结论

本试验表明，在体外条件下百里香精油可以有效地抑制马铃薯立枯丝核菌病原菌菌丝的生长，在较低浓度下（0.4μL/mL）即可完全抑制其菌丝的生长。研究显示，百里香精油还拥有广谱的抑菌作用，因此百里香精油具有开发为高效抑菌的植物源农药的潜力。试验还表明，百里香精油与抗真菌类抗生素多抗霉素之间具有协同作用，二者配合使用可以显著地提高抑菌效率，降低药物使用量，为生物农药的开发提供依据。

另外，从试验中可以看出，百里香精油的抑菌效果随时间的推移而下降，这与精油易挥发的性质有关。所以，要想高效利用百里香精油作为抑菌农药，还需探索其使用方式，以避免其挥发浪费。

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作者简介：张阿强，在读硕士研究生，研究方向：资源与环境微生物。