树鼩经甲型肝炎减毒活疫苗、乙型肝炎疫苗及联合硫酸乙酰肝素佐剂免疫后的免疫效果评价

王东宝, 胡云章, 胡凝珠, 罕园园, 匡德宣, 李彦涵

(中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心,云南省虫媒传染病防控研究重点实验室, 昆明650118)

树鼩经甲型肝炎减毒活疫苗、乙型肝炎疫苗及联合硫酸乙酰肝素佐剂免疫后的免疫效果评价

王东宝, 胡云章, 胡凝珠, 罕园园, 匡德宣, 李彦涵

(中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心,云南省虫媒传染病防控研究重点实验室, 昆明650118)

目的 探讨甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-l)、乙型肝炎疫苗(Hbv)以及HepA-l、Hbv分别与佐剂硫酸乙酰肝素(HS)联合对树鼩进行免疫后树鼩体液免疫应答的影响。方法 按照疫苗种类、佐剂以及免疫途径将树鼩随机分组，同时设空白对照组，分别于末次免疫后的4周、8周、12周、16周和20周尾静脉采血，用ELISA法检测树鼩血清中的特异性IgG抗体水平。结果 除空白对照组外，实验组均在末次免疫的第四周检测到抗甲型肝炎病毒(HAV)及抗乙型肝炎病毒(HBV)抗体，抗体水平随着免疫时间延长而逐渐升高并于12周达到峰值，此后逐渐下降。同时，联合HS佐剂组的体液免疫效果均优于单纯疫苗免疫组。并且不同抗原以及联合佐剂采用不同的免疫途径免疫树鼩其免疫效果存在显著性差异。结论 通过对树鼩进行疫苗免疫原性和增强免疫效果检测，证实以树鼩作为动物模型进行疫苗评价的可行性。

树鼩; 甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-l); 乙型肝炎疫苗(Hbv); 硫酸乙酰肝素(HS); 体液免疫

树鼩(Tupaia belangeri, Tree shrew)是一种生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀鼩类的小型动物, 在进化过程中处于食虫类和灵长类之间，与人类有较近的亲缘关系[1,2]。由于其生理特征和解剖结构都更接近于非人灵长类动物的特点，已用于环境压力、生殖及神经生理学以及包括单纯性疱疹病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、基孔肯雅病毒等病毒感染方面的研究[3-6]。因此以树鼩作为人类重大疾病研究的动物模型，在医学生物学上已呈现出广阔的应用前景[4,7-9]。

目前国内外对疫苗评价大多选用小鼠或灵长类动物模型，而以树鼩作为动物模型对疫苗进行有效性评价却缺乏报道，制约了树鼩动物模型标准化的建立[10-12]。本实验以树鼩为动物模型，以单独甲型肝炎减毒活疫苗(Hepatitis A virus attenuated live vaccine, HepA-l)、乙型肝炎疫苗(Hepatitis B vaccine, Hbv)以及HepA-l、Hbv分别与佐剂硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate, HS)联合以皮下及肌肉两种方式对树鼩进行免疫。观察免疫后树鼩对疫苗及疫苗与佐剂联合后体液免疫应答的影响，为树鼩作为动物模型进行疫苗免疫或药物评价提供免疫学指标，并为树鼩标准化模型的建立完善数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级成年雄性树鼩，体质量130～160 g，来源于中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心[SCXK(滇)K2013-0001]。所有相关操作均按照医学生物学研究所动物实验伦理委员会要求进行,动物饲养设施符合相关标准[SYXK(滇)K2014-0007]。

1.2 疫苗及抗原

甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-l)，HAV抗原滴度为256 EU/mL, 由中国医学科学院医学生物学研究所提供; 甲型肝炎抗原(HAV颗粒), 由中国医学科学院医学生物学研究所提供; 重组Hbv(汉逊酵母)，规格10 μg/0.5 mL, 购自大连汉信生物制药有限公司。

1.3 主要试剂

ELISA检测试剂盒(Anti-Mouse ABT System)购自美国KPL公司；辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)标记的兔抗树鼩IgG二抗由本所孙茂盛课题组提供; HS(1 mg/mL)购自美国Sigma公司。

1.4 疫苗与佐剂的使用剂量及制备

本实验室前期以小鼠为动物模型摸索出单独免疫HepA-l合适的使用剂量是18 EU, 单独免疫Hbv合适的使用剂量是 5 μg, HS合适的使用剂量是100 μg[9]。将抗原与佐剂混合后，在漩涡振荡仪上剧烈震荡混匀, 备用。

1.5 动物分组及免疫

将成年健康雄性树鼩按抗原种类、佐剂、免疫途径随机分10组，每组8只，同时设空白对照组，详细分组情况见表1。

表 1 各组抗原佐剂含量及免疫途径和程序Table 1 Dosages of antigen, adjuvant, immune routes and schedules of various groups

1.6 树鼩血清抗体水平检测

采用间接ELISA法。分别于二次免疫后的0周、4周、8周、12周、16周、20周，经树鼩尾静脉采血0.5 mL，分离血清，从40倍起倍比稀释后，间接ELISA法检测抗-HAV、抗-乙型肝炎病毒(HBV)特异性IgG水平，其中二抗为本所自备的HRP标记的兔抗树鼩IgG二抗，其余操作按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学分析

应用Graphpad prism 5软件进行统计学分析，实验数据以±s，组间比较采用配对t 检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体液免疫结果

空白对照组树鼩在各检测时间点均无IgG抗体的产生，除空白对照组外，所有实验组都在末次免疫后的4周、8周、12周、16 周产生抗-HAV IgG或抗-HBV IgG, 并且抗体水平随着免疫时间延长而逐渐升高，于12周达到峰值，此后逐渐下降。各组树鼩免疫后血清特异性IgG水平及各组间差异详见图1。

2.1.1 单独抗原组与混合HS组体液免疫效果评价相同的免疫途径下免疫2次后，抗原混合HS后树鼩的抗体滴度更高，体液免疫的效果更好。其中，以皮下免疫途径的第1组单独免疫HepA-l组与第2组HepA-l +HS佐剂免疫组，第3组单独免疫Hbv组与第4组Hbv+HS免疫组，以及以肌肉免疫途径的第6组单独免疫HepA-l组与第7组HepA-l +HS佐剂免疫组，第8组单独免疫Hbv组与第9组Hbv+HS免疫组, 组间比较采用t检验, 差异具有统计学意义(P2-1=0.048 1，P4-3＜0.000 1, P7-6＜0.000 1, P9-8＜0.000 1，P均＜0.05)。结果表明，HS具有较好的免疫佐剂效应，能够显著增强抗原特异的体液免疫应答。

图1 不同时间各组小鼠血清IgG水平*indicate P＜0.05,**indicate P＜0.01,***indicate P＜0.001Figure 1 IgG titers in sera of mice in different groups at different times

2.1.2 不同免疫途径体液免疫效果评价 第1组与第6组单独免疫HepA-l组分别以皮下和肌肉两种免疫途径对树鼩进行免疫，组间比较差异具有统计学意义(P6-1=0.015 9, P＜0.05)。结果表明, 以树鼩作为动物模型单独免疫HepA-l皮下免疫途径体液免疫效果更好。第2组与第7组HepA-l+HS免疫组分别以皮下和肌肉两种免疫途径对树鼩进行免疫, 皮下免疫组在每个时间点的抗体滴度均高于肌肉免疫组, 但组间比较差异无统计学意义(P7-2=0.8985)。第3组和第8组单独免疫Hbv组分别以皮下和肌肉两种免疫途径对树鼩进行免疫，皮下免疫组抗体滴度均高于肌肉免疫组，但组间比较差异不具有统计学意义(P8-3=0.068 2)。第4组与第9组Hbv+HS免疫组分别以皮下和肌肉两种免疫途径对树鼩进行免疫，组间比较差异具有统计学意义(P9-4=0.048 1, P＜0.05)。结果提示, 以树鼩作为动物模型Hbv与佐剂HS联合免疫, 皮下免疫途径的体液免疫效果更好。

2.2 安全性评价

实验期间各组树鼩体质量、毛色均正常，未出现蜷缩、竖毛、搔鼻、抽搐、痉挛、水肿及休克等异常反应，各组树鼩注射部位均未出现红肿、结节，进食、水、粪便和精神等均正常。实验结束树鼩无死亡。

3 讨论

非人灵长类动物与人类的关系最为密切，其在形态、生理机能和生化代谢等方面与人类接近，但由于资源珍贵，成本太高等原因使灵长类动物如猴子的应用受到很大的限制。因此，免疫学和生理学特征与灵长类动物接近的树鼩引起学者的广泛关注[9,13]。树鼩体型小，易驯养，繁殖能力强，新陈代谢等生理特征和解剖结构都更接近于非人灵长类动物，存在诸多自发性疾病的特性，可以作为某些人类重大疾病研究的动物模型, 在医学生物学上已呈现出广阔的应用前景[14-17]。

目前国内外对于疫苗评价大多选用小鼠或者灵长类动物模型，各种检测技术都比较成熟，但目前还尚未有树鼩作为动物模型进行疫苗安全性和有效性评价的相关报道。

本实验对树鼩进行HepA-l疫苗、Hbv疫苗及联合HS佐剂免疫后的免疫效果评价，并对皮下和肌肉两种免疫途径的免疫效果进行比较。研究结果表明除空白对照组外，其余组均在末次免疫的第4周检测到抗-HAV及抗-HBV抗体，并且抗体水平随着免疫时间延长而逐渐升高，于第12周达到峰值, 此后逐渐下降。说明以树鼩作为动物模型进行疫苗检测是可行的，树鼩可以对疫苗产生良好的免疫应答, 体液免疫效果复合研究预期。HS是一类广泛分布于细胞外基质的糖胺聚糖，当细胞外基质发生炎症或损伤时, 降解为可溶性低分子量HS[18,19]。文献报道[20]，HS作为免疫佐剂能增强以小鼠为动物模型的体液免疫应答，并且对于以HBV亚单位为抗原的体液免疫增强效应优于铝佐剂或与铝佐剂相当。本实验对疫苗联合HS佐剂的体液免疫效果进行检测，结果表明联合HS佐剂组的体液免疫效果均优于单纯疫苗免疫组，统计学分析具有显著性差异，说明HS具有的免疫佐剂效应能够显著增强以树鼩为动物模型的抗原特异的体液免疫应答。同时，本实验还对不同免疫途径的免疫效果进行了比较。数据分析显示，单独HepA-l组以及Hbv联合HS组皮下免疫的体液免疫效果显著优于肌肉免疫的体液免疫效果，单独Hbv组以及HepA-l组联合HS组皮下免疫的抗体滴度虽然在每一个检测点都高于肌肉免疫组的抗体滴度，但统计学分析不具有显著性差异。结果表明，以树鼩作为动物模型，免疫途径的选择需要更为慎重，不同的抗原免疫需要摸索不同免疫途径，甄选出适合该抗原的最佳免疫途径才能获得满意的免疫效果。

综上所述，本实验通过对树鼩进行疫苗免疫原性和增强免疫效果的检测，初步了解其在免疫学方面的特点，证实了以树鼩作为动物模型进行疫苗评价的可行性，不仅为以后疫苗及药物评估平台建设提供基础数据，同时也为树鼩种质资源的开发奠定坚实的基础。

[1] Yang C, Ruan P, Ou C, et al. Chronic hepatitis B virus infection and occurrence of hepatocellular carcinoma in tree shrews (Tupaia belangeri chinensis)[J]. Virol J, 2015, 12:26.

[2] Li SA, LEE WH, Zhang Y. Two bacterial infection models in tree shrew for evaluating the efficacy of antimicrobial agents [J]. Zool Res, 2012, 33(1):1-6.

[3] Tong Y, Zhu Y, Xia Y, et al. Tupaia CD81, SR-BI, claudin, and occludin support hepatitis C virus infection [J]. Virol J, 2011, 85(6):2793-2802.

[4] 黄晓燕, 徐娟, 孙晓梅, 等. 树鼩在人类疾病动物模型中应用研究进展[J], 实验动物科学, 2013, 30(2):59-64.

[5] Bukh J, Lanford RE, Purcell RH. Persistent human hepatitis B virus infection in cynomolgus monkeys:a novel animal model in the search for a cure [J]. Hepatology, 2013, 58(5): 1533-1536.

[6] Wang Q, Schwarzenberger P, Yang F, et al. Experimental chronic hepatitis B infection of neonatal tree shrews (Tupaia belangeri chinensis): a model to study molecular causes for susceptibility and disease progression to chronic hepatitis in humans[J]. Virol J, 2012, 9:170.

[7] 严瑞琪, 苏建家, 陈志英, 等. 人乙型肝炎病毒实验感染成年树鼩的初步研究[J]. 广西医学院学报, 1984, 1(1):10-15.

[8] Wang BJ, Tian YJ, Meng ZJ, et al. Establishing a new animal model for hepadnaviral infection: susceptibility of Chinese Marmota species to woodchuck hepatitis virus infection [J]. Gen Virol, 2011,92(3):681-691.

[9] He W, Ren B, Mao F, et al. Hepatitis D virus infection of mice expressing human sodium taurocholate co-transporting polypeptide[J]. PLoS Pathog, 2015, 11(4):e1004840.

[10] Bility MT, Cheng L, Zhang Z, et al. Hepatitis B virus infection and immunopathogenesis in a humanized mouse model: induction of human-specific liver fibrosis and M2-like macrophages[J]. PLoS Pathog, 2014, 10(3):e1004032.

[11] Walter E, Keist R, Niederost B, et al. Hepatitis infection of tupaia hepatocytes in vitro and in vivo[J]. Hepatology, 1996, 24(1):1-5.

[12] Fan Y, Huang ZY, Cao CC, et al. Genome of the Chinese tree shrew [J]. Nat Commun, 2013, 4:1426.

[13] Fan Y, Yu D, Yao YG. Tree shrew database (Tree shrew DB): agenomic knowledge base for the Chinese tree shrew[J]. Sci Rep, 2014, 4:7145.

[14] 李海燕, 黎家敏, 李靖潇, 等. 高糖高脂饲料联合地塞米松诱发树鼩血糖、血脂异常[J]. 实验动物与比较医学, 2010, 30(3):197-200.

[15] Meng BH, Liu H, Liang Y, et al. Investigation of pathogenesis of diabetic myopathy of skeletal muscle in experimental type I diabetes mellitus of tree shrews[J]. Chin J Diabetes, 2005, 13(4):290-292.

[16] 江勤芳, 匡德宣, 仝品芬, 等. 树鼩规模化繁殖及繁殖群建立[J]. 实验动物科学, 2010, 28(6):35-38.

[17] 兰芸, 王海漩, 乌美妮, 等. 内源性危险信号低分子量硫酸乙酰肝素的免疫佐剂作用[J]. 中国生物制品学杂志, 2011, 24(1):5-9.

[18] 施建东, 胡凝珠, 赵蕊蕊, 等. 氢氧化锌与低分子量透明质酸复合佐剂对甲肝乙肝联合抗原的体液免疫增强作用[J].中国生物制品学杂志, 2012, 25(1):34-36.

[19]梁亮, 李媛, 岳慧芬, 等. 用人工繁殖的围生期和幼年期树鼩感染人乙型肝炎病毒的初步研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2006, 22(8):792-795.

[20] Powell JD, Horton MR. Threat matrix: low-molecular-weight hyaluronan（HA）as a danger signal[J]. Immunol Res, 2005, 31(3):207-218.

The Immunity Effect Evluation on Tree Shrew by Hepatitis A Virus Attenuated Live Vaccine, Hepatitis B Vaccine Independently or Combined Adjuvant Heparan Sulfate

WANG Dong-bao, HU Yun-zhang, HU Ning-zhu, HAN Yuan-yuan, KUANG De-xuan, LI Yan-han
(Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical College and Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research & Development on Severe Infectious Diseases, Yunnan Research Center of Engineering Technique for Vaccines against Severe Infectious Diseases, Yunnan Key Laboratory of Prevention & Control Research on Insect-Borne Infectious Diseases, Kunming 650118, China)

ObjectiveTo investigate the humoral immune response of tree shrew after the immunization of Hepatitis A attenuated live vaccine (HepA-l)、Hepatitis B vaccine (Hbv) independently and combined with adjuvant heparan sulfate (HS).MethodsThe tree shrews were randomly divided into 10 groups by the type of vaccine, adjuvant and schedules. The specific IgG levels in sera of tree shrew were determined by ELISA at 4, 8, 12, 16 and 20 weeks after the last immunization respectively.ResultsExcept the blank control group, the anti - hepatitis A virus (HAV) and anti - hepatitis B virus (HBV) antibody was detected in all the experimental group at 4 weeks after last immunization, the level of immune antibody were gradually increased with time and reached the peak at the 12 weeks, then decreased gradually. At the same time, the humoral immunity effect of HS adjuvant group were better than that of vaccine group. There is a significant difference on immunity among tree shrews with different antigens and adjuvant by different immunization schedules.ConclusionThe immune effect of vaccine immunogenicity and immune enhancing effect on tree shrew confirms the feasibility of the tree shrew as an animal model.

Tree shrew; Hepatitis A virus attenuated live vaccine (HepA-l); Hepatitis B vaccine (Hbv); Heparan sulfate (HS); Humoral immunity

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0113-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.006

2017-01-16

国家科技支撑计划项目(2014BAI01B01); 国家重点研究计划生物安全关键技术研究发重点专项(2016YFC1202300)

王东宝(1975-), 男, 主管技师, 研究方向: 生物制品开发。E-mail: 285209690@qq.com

李彦涵(1982-), 女, 硕士, 助理研究员, 研究方向: 疫苗研发。E-mail: 110393273@qq.com