隔药饼灸对慢性肾功能衰竭兔血清TGF—β1及肾功能的影响

左政+陈晓梅+姜云武+杨艳梅+王斌尧

摘要：目的探討隔药饼灸对慢性肾功能衰竭兔血清TGF-β1及肾功能的影响。方法选取兔45只随机分成A组（空白对照组）：5只；B组（模型组）：10只；C组（隔药饼灸组）：10只；D组（直接灸组）：10只。E组（氯纱坦钾组）：10只。除A组外，其余各组采用腺嘌呤灌胃致兔肾间质纤维化，建立CRF动物模型，C组运用肾衰药粉制成灸饼，艾绒制成艾柱，隔药饼灸进行干预，B、D、E组给予相应治疗，3个月后检测各组兔血清TGF-β1及肾功能、24h尿蛋白变化。结果除A组外，其余各组家兔在造模后肾功（尿素氮、肌酐）和24h尿蛋白定量均有显著升高，表明本实验用腺嘌呤造模成功。除A组外，其余各组经相应治疗后血清TGF-β1、肾功和24h尿蛋白定量均有所恢复，其中C组（隔药饼灸组）恢复较明显，与B、D、E组比较有明显差异（P<0.05），有统计学意义；而D、E组比较差异不明显（P>0.05），无统计学意义。结论隔药饼灸能明显降低CRF兔血清TGF-β1及肾功能、24h尿蛋白定量水平，是临床治疗CRF的有效方法。

关键词：隔药饼灸；慢性肾功能衰竭；TGF-β1；肾功能；24h尿蛋白定量

中图分类号：R256.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）04-0082-03

Effect of Medicinal Cake Partition Moxibustion on Serum TGF-β1

and Renal Function in Chronic Renal Failure Rabbits

RUO Zheng1， CHEN Xiao-mei2， JIANG Yun-wu1， YANG Yan-mei1， WANG Bin-yao1

（1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， Yunnan；

2. Guanzunxin Hospital， Kunming 550000， Yunnan）

【Abstract】Objective： To study the effect of Medicinal Cake Partition Moxibustion on the serum TGF-β1 and renal function in chronic renal failure rabbits. Methods： 50 rabbits were randomly divided into group A （blank control group）， 5 rats； group B （model group）， 10 rats； group C （cake partition moxibustion group）， 10 rats； group D （direct moxibustion group）， 10 rats； Group E （losartan potassium group）， 10 rats. Except group A， the other groups were given adenine gavage to induce renal interstitial fibrosis in rabbits for the establishment of CRF animal models. Group C was intervened by using renal failure powder moxibustion cake， moxa cone， and medicinal cake partition moxibustion. Group B， D and E were given the corresponding treatment. 3 months later， the serum TGF-β1， renal function and 24h urine protein changes of the rabbits were detected. Results： Except group A， the renal function （urea nitrogen， creatinine） and 24h urine protein of the other groups significantly increased， indicating that the modeling was successful with adenine. Except group A， the srmeu TGF-β1， renal function and 24h urine protein of the rest groups were restored after the corresponding treatment， of which group C （cake partition moxibustion group） recovered more obviously. Compared with group B， D and E， the difference was significant （P<0.05）. Compared with group D and E， the difference was not significant （P>0.05）. Conclusion： Medicinal Cake Partition Moxibustion can significantly reduce the levels of serum TGF-β1 and renal function and 24 h urine protein in CRF rabbits， which is an effective method for clinical treatment of CRF.

【Key words】Medicinal Cake Partition Moxibustion， chronic renal failure， TGF-β1 and renal function， 24h urine protein quantitation

慢性肾功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是所有原发性或继发性肾脏疾患所致进行性肾功能损害所出现的一系列症状或代谢紊乱组成的临床综合征[1]。是临床的一种难治病症，预后差。其主要病变为肾单位的病变、进行性恶化，具体表现为肾小球的硬化、肾小管的变性萎缩、肾间质的纤维化。肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病进展为终末期肾功能衰竭的共同通路，是多种原因共同作用的结果，它以肾间质中细胞及胶原成分集聚增多，伴有肾小管萎缩或扩张变形，小管周围毛细血管减少、荒废，完整肾单位的进行性减少，肾小球滤过率的持续性下降为特征。这一病变过程涉及细胞、细胞因子、细胞外基质、生长因子及它们之间的相互作用[2]。其中，TGF-β1是目前公认的最强的致纤维化因子，它是参与肾小球硬化及肾小管间质纤维化的关键细胞因子，近年来关于TGF-β1的研究多是探索它的信号转导途径。本文就隔药饼灸对慢性肾功能衰竭兔血清TGF-β1及肾功能的影响进行了相关研究，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验药物肾衰灸粉：黄芪、党参、熟地、炙仙灵脾、山茱萸，按3：3：2：1：1比例配方，将上述中药配方打磨成细药粉。灸饼制作：用5 mL注射器去头后制成灸饼模具。将上述灸粉用2%利多卡因调匀成糊状后，置于注射器模具中压紧，后推出2～3 mm药饼，用细线切割，制成直径（1±0.2）cm，厚（2～3）mm，重2.5 g的圆型薄饼。艾柱制作：用自制圆锥形艾柱模具制作。用天平称称取艾绒200 mg，将细艾绒填塞至艾柱模具制成炷底直径约0.5 cm，炷高0.5 cm大小艾柱。腺嘌呤（广州生产威佳科技有限公司），氯沙坦钾片（科素亚100 mg/片，杭州默沙东制药有限公司批号：国药准字J20120045））

1.1.2实验试剂及主要仪器ELISA试剂盒、离心机（美国Beckman公司），ELISA法检测（SEAC型免疫测定仪，意大利），全自动生化分析仪（日本日立产日立71705型），考马斯亮蓝G-250：（加拿大Sangon公司）；尿蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所），超低温冰箱（青岛海尔），无菌器械、手术台、电子分析天平、兔固定抽血盒、艾灸固定架等。

1.1.3实验动物健康新西兰纯种雄性兔45只，由昆明医科大学提供，清洁级、体质量1.8～2.2kg，适应性饲养1周。

1.2实验方法

1.2.1动物分组及处理用组间对比设计。将家兔按随机数字表进行随机分组，分成A组：空白组（空白对照组）5只；B组：模型组（AS模型组）10只；C组：隔药饼灸组（AS模型+隔药饼灸）10只；D组：直接灸组（AS模型+艾炷直接灸）10只。E組：（AS模型+氯纱坦钾组）10只。每笼1只分开饲养。

A组造模结束后每天给予常规普通饲料喂养，不进行任何干预。其余各组造模成功后：B组给予常规普通饲料喂养，不给予任何药物，不行任何治疗。C组：取穴定位：参照新世纪全国高等中医院校规划教材《实验针灸学》[3]以及拟人比照法制订，腹部穴位：从胸剑联合至耻骨上缘分 13 等分（寸）。Ⅰ组：肾俞，脾俞；Ⅱ组：足三里，关元。取穴定位后剪毛，将肾衰灸饼置于穴位上，艾炷放在药饼上施灸，每天灸1组穴位，每穴灸3壮，2组交替。灸后如出现水泡，保持清洁干燥，避免感染。D组直接将艾柱置于穴位上（艾炷下有垫盘），取穴同隔药饼灸组，每天灸1组，每穴灸3壮，2组交替。壮的大小以隔药饼灸组一致。E组氯沙坦按10 mg/kg/d混悬液剂量给兔灌胃。

1.2.2动物造模动物饲养于正常光照的清洁实验室中适应性饲养1周后，A组用等量蒸馏水灌胃21 d，除A组外，其余40只家兔进行造模，按参考文献[4]予以25%腺嘌呤（用生理盐水配成250 mg/mL的悬浮液）按250 mg/kg/d/只的剂量灌胃21 d，造模时间为3周，3周时形成典型的CRF模型。

2观察指标和测定方法

以上各组治疗持续3个月，3个月后各组兔经静脉注入10 mL空气处死，处死前经兔耳中央动脉抽血8ml，待行相关检测。

2.1一般常规检查（血常规、肾功、24 h尿蛋白）所有组别家兔均在造模前、造模后、治疗3个月后分3次检测以下3项：（1）生物化学检测（每次经兔耳中央动脉抽血4 mL）：测定血常规、肾功；（2）尿蛋白定量：将动物置入代谢笼留取24 h尿液，以考马斯亮蓝法行尿蛋白定量检测。

2.2血清TGF-β1水平所有组别兔在治疗3个月后处死，处死前经耳中央动脉抽血4ml采血，在采血后，置于3000 r/min离心机离心取血清，冻存于-20℃冰箱，检测前血清及试剂放置室温充分解冻，混合均匀，同时避免反复冻融，ELISA法检测，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2.3统计学处理方法采用SPSS18.0软件进行统计分析，实验结果以平均值±标准差（x±s）表示，进行组间疗效比较及动态疗效分析，计量资料用方差分析，计数资料用卡方检验，以P<0.05作为有显著性统计学意义，以P<0.01作为有高度显著性统计学意义。

3结果

3.1各组家兔肾功、尿蛋白检测结果由表（1）可以看出，除A组（空白对照组）外，其余各组家兔在造模后肾功（尿素氮、肌酐）和24 h尿蛋白定量均有显著升高，表明用腺嘌呤造模成功；除A组外，其余各组经相应治疗后肾功、24 h尿蛋白定量均有所恢复，其中C组（隔药饼灸组）恢复较明显，与B、D、E组比较有明显差异（P<0.05），有统计学意义；而D、E组比较差异不明显（P>0.05），无统计学意义。

3.2各组家兔血清TGF-β1检测结果研究表明，治疗后各组兔血清TGF-β1检测结果，A组（空白对照组）与C组比较差异不明显（P>0.05），无统计学意义，表明隔药饼灸明显降低了兔血清TGF-β1水平，A组（空白对照组）与B、D、E组比较有明显差异（P<0.05），有统计学意义，表明治疗后D、E组家兔血清TGF-β1水平降低不明显。见表（2）

慢性肾功能衰竭（CRF）为多种慢性肾脏疾病晚期肾功能严重受损导致的一系列综合征，是世界公认的难治病，病程绵长且后期肾脏的替代治疗均给社会与家庭带来极大经济负担，严重威胁着患者的生命与健康。西医认为CRF是“慢性、进行性、不可逆的疾病”，其终末期为尿毒症；血液透析、腹膜透析、肾移植是目前西医治疗的方法，透析对肾衰没有治療作用，只是代替肾脏排出体内的一些代谢废物，根据“用进废退”法则，透析时间长了，肾脏就会萎缩、废用。CRF属于中医“水肿”、“溺毒”、“癃闭”、“关格”、“腰痛”、“虚劳”等范畴[5]，临床往往累及多个脏腑，但其病位常在脾、肾两脏。从辨证识病的角度审视肾病，总体判定为虚实夹杂，寒热交错。恶心、呕吐、大便秘结、浮肿、舌苔厚腻、白腻、黄腻等症状又反映了邪实的一面，正虚为本，邪实为标，由虚致实。

原发性肾病、肾血管病变和慢性间质性肾炎的病变发展到慢性肾功能衰竭的发病机制，至今尚未完全阐明[6]。传统观点认为与肾小球的硬化，肾小管的炎变、萎缩，肾小管间质的纤维化有关。近年来认为决定CRF疾病预后的主要因素是肾小管间质损害，而非肾小球[7]。这一病变过程涉及细胞、细胞因子、细胞外基质（ECM）、生长因子及它们之间的相互作用[8]。其中，TGF-β1是目前公认的最强的致纤维化因子，它是参与肾小球硬化及肾小管间质纤维化的关键细胞因子，近年来关于TGF-β1的研究多是探索它的信号转导途径。腺嘌呤致兔慢性肾功能衰竭模型是较成熟的、学术界公认的造模方法。本实验以造模前后各检测肾功能、血压、24h尿蛋白等指标表明，模型建成后表现为大量蛋白尿，血压、Scr、BUN升高，是正常的3～4倍，证明造模成功，且造模稳定性好，3周时形成典型的CRF模型。

艾灸属祖国医学针灸学的范畴。隔药饼灸是中医针灸疗法的重要组成部分，它借助艾灸的温热效应和药物的作用，达到治疗疾病的目的。通过艾灸的热力作用，将药物的有效成分透过皮肤渗入腧穴，将艾灸与腧穴、药物辨证结合，从而产生了隔药饼灸的“综合效应”。国外研究表明，肾内缺氧可以直接参与肾间质纤维化致肾功能衰竭[9]。隔药饼灸作用机理主要涉及艾的药性作用及成分、温热效应、光辐射效应、艾的燃烧生成物及芳香疗法、药饼等六个主要因素及其综合作用。其作用并不是上述诸因素的简单叠加，而是其相互作用、相互补充的结果。艾灸自身的作用、经络腧穴的作用及药物作用于经络腧穴的途径，三者的有机结合形成了隔药饼灸疗法的综合作用。隔药饼灸可能通过增强机体非特异性和特异性免疫功能的作用，增强肾小球的滤过功能，改善肾脏缺血缺氧，恢复肾功能，该研究结果为临床推广应用隔药饼灸提供了理论基础。但隔药饼灸在治疗慢性肾功能衰竭中干预TGF-β1/Smad 信号通路的更深入的靶点有待进一步研究。

参考文献：

[1]刘爱凤，陆良钧.食管异物150 例病因分析及对策[J].基层医学论坛，2007，11（6B）：500-501.

[2]Pawluczyk IZ，Harris KP.Cytokine interations promote synergistic Fibronectin accumulation by mesangial cells[J].Kidney Int，1998，54：62.

[3]李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003：327-329.

[4]周小舟，张盛光，阳晓，等.腺嘌呤所致CRF大鼠的机理研究[J].基础医学与临床，1997，17（1）：54-57.

[5]左政，陈晓梅，姜云武，等.管氏肾病四联疗法治疗慢性肾功能衰竭疗效观察[J].中国针灸，2014，34（7）：641-645.

[6]Bohle A，Muller GA，Wehrmann M，et al.Pathogenesis of chronic renal failure in the primary glomerulopathies，renalvasculopathies，and chronic interstitial Nephritides[J].Kidney Int，1996；49（Suppl；54）：S2-S9.

[7]王海燕.肾脏病学[M]（第2版）.北京：人民卫生出版社，1996：47.

[8]EDDY A A.Moleucular basis of renal fibrosis[J].Pediatr Nehrpol，2000，15：290-301.

[9]Kim JH，Kim BK，Moon KC，et al.Activation of the TGFbeta/Smad signaling pathway in focal segmental glomerulosclerosis[J].Kidney Int，2003，64（5）：1715-1721.