高压氧联合仙桃草饲喂治疗兔骨缺损效果观察

席立成，李宏宇，赵子星，郁少林，刘搏宇(广西壮族自治区人民医院，南宁 530021)

高压氧联合仙桃草饲喂治疗兔骨缺损效果观察

席立成，李宏宇，赵子星，郁少林，刘搏宇
(广西壮族自治区人民医院，南宁 530021)

目的 观察用高压氧联合仙桃草饲喂治疗兔骨缺损的效果。 方法 选用新西兰大白兔80只制作兔骨缺损模型，随机分为A、B、C、D组，A组给予高压氧联合仙桃草饲喂治疗、B组给予高压氧治疗、C组给予仙桃草饲喂治疗，D组为正常对照不用药。分别于治疗后第2、4、8、12周分批处死各组兔，在电镜、光镜下计数新生骨痂成骨细胞数及新生骨小梁面积比，电镜下观察成骨细胞和骨股原纤维形态。 结果 光镜下治疗后2、4、8、12周A组兔骨痂新生骨小梁镜下面积比和成骨细胞计数高于B、C、D组(P均<0.05)，B、C组兔骨痂新生骨小梁镜下面积比和成骨细胞计数高于D组(P均<0.05)。电镜下观察，与B、C、D组比较，A组成骨细胞细胞器最发达，骨胶原纤维排列整齐, 分布均匀。 结论 高压氧联合仙桃草饲喂治疗兔骨缺损，可明显增强成骨细胞增殖分化及成骨能力,加快骨小梁生成，促进骨缺损的愈合，效果强于单用高压氧或者仙桃草者。

高压氧；仙桃草；骨缺损；成骨细胞；骨小梁；动物实验

目前临床上常用的骨缺损治疗方法主要有自体骨移植、同种异体骨移植、人工骨移植等，但均存在不足。寻找一种有效的常规保守治疗骨缺损的方法非常重要。高压氧能促进骨折愈合，缩短骨折愈合时间。仙桃草又名接骨草，中医认为仙桃草有“接骨”功效。本研究用高压氧联合仙桃草饲喂治疗兔骨缺损，观察模型兔新生骨痂中骨小梁和成骨细胞生长情况。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选用标准实验新西兰大白兔80只，体质量3.0～3.5 kg，兔龄5～6个月，雌雄不拘。动物高压氧舱(型号03-Y900-001，中国烟台)，光学显微镜(型号Olympus BX40，日本)，电子显微镜(型号日立H-7650，日本)，电子天平，解剖工具。

1.2 兔骨缺损模型制作、分组及治疗方法 采用文献方法于兔左桡骨中段制作长约1.5 cm骨缺损，切除骨膜，缝合包扎。术后3 d内每日注射硫酸庆大霉素注射液1次，16万U/次。均造模成功。随机分为A、B、C、D组，各20只。A组予高压氧联合仙桃草饲喂治疗；B组予高压氧治疗；C组行仙桃草饲喂治疗；D组为对照组。高压氧治疗压力0.25 MPa (2.5 个大气压)，加压时间25～30 min，稳压时间60～70 min，减压时间31～35 min，1次/d，9次为1个疗程。每个疗程后休息2～3 d，然后继续治疗4个疗程。A、C组兔从造模后第1天起每日每只兔给含仙桃草精饲料65 g，含生药1.2 g；C、D组给等量精饲料。治疗后第2、4、8、12周各组分批处死5只兔。取出骨缺损间隙的骨痂进行后续实验。

1.3 各组兔骨痂新生骨小梁镜下面积比测算方法 将骨痂置入10%甲醛中固定24 h，依次行EDTA脱钙，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，HE染色，4 μm连续切片，封片后光学显微镜下组织学观察。新生骨小梁镜下面积比检测采用Lane-Sandhu骨移植物组织学评分法。选取每个标本中无明显组织分离、相同深度的 5 张切片进行骨形态计量分析，在放大100 倍条件下，每张切片上随机选取 5 个视野，测定两组各时间点新生骨小梁面积占镜下修复区面积的比值(新生骨小梁镜下面积比)。

1.4 各组兔骨痂成骨细胞计数方法 将骨痂用多聚甲醛固定，EDTA 脱钙，常规脱水，石蜡浸润包埋，4 μm 厚连续切片，采用免疫组化法进行碱性磷酸酶(ALP)染色，成骨细胞胞质蓝染，在低倍镜下找到骨小梁位置，然后换成40倍镜，依照上下、左右的顺序，选取5个骨小梁区域进行成骨细胞计数。

1.5 各组兔电镜下成骨细胞和骨胶原纤维形态观察方法 截取1 mm×2 mm大小的骨痂标本，投入4 ℃的3%戊二醛、1.5%多聚甲醛液固定后，用5.5%EDTA、1%戊二醛、二甲胂酸钠液(pH值7.2)4 ℃脱钙，漂洗后用1%四氧化锇固定，再漂洗后逐级脱水，环氧树脂包埋。经半薄切片定位，超薄切片70 nm，染色后电子显微镜下观察成骨细胞和骨胶原纤维形态。

2 结果

2.1 各组兔骨痂新生骨小梁镜下面积比比较 治疗后各组兔骨痂新生骨小梁镜下面积比逐渐升高。治疗后第2周时，A组骨小梁排列不规则，数量不多，B、C组骨小梁量更少，D组骨小梁少，且密度稀疏、体积细小；第4周时，A组骨小梁周围大量成骨细胞围绕，骨小梁体积粗大，部分连接成网络，B、C组骨小梁数量较多，但未见链接成网络，骨小梁周围较多成骨细胞，D组骨小梁增多，排列不规则；第8及12周时，A组骨小梁全成网络状，B、C组骨小梁部分成网络状，D组骨小梁排列欠规则。各时点各组兔骨痂新生骨小梁镜下面积比见表1。治疗后2、4、8、12周A组兔骨痂新生骨小梁镜下面积比高于B、C、D组(P均<0.05)，B、C组兔骨痂新生骨小梁镜下面积比高于D组(P均<0.05)。

表1 各时点各组兔骨痂新生骨小梁镜下面积比比较±s)

注：与B组相比，*P<0.05；与C组相比，#P<0.05；与D组相比，▲P<0.05。

2.2 各组兔骨痂成骨细胞计数比较 治疗后各组兔骨痂成骨细胞计数逐渐升高，至治疗后8周达到高峰，然后下降。治疗后2、4、8、12周各组兔骨痂成骨细胞计数见表2。

表2 各时点各组兔骨痂成骨细胞计数比较±s)

注：与B组相比，*P<0.05；与C组相比，#P<0.05；与D组相比，▲P<0.05。

2.3 各组兔骨痂电镜下成骨细胞及骨胶原纤维形态 电镜下观察，第2周时A组成骨细胞较其他三组明显多，并可见排列紊乱的骨胶原纤维，B、C组胶原纤维少，成骨细胞数量和体积均小，D组骨胶原纤维细小且连续性差。第4周时，A组成骨细胞体积较大，内质网及线粒体较多，胶原纤维胶致密，分布均匀，B、C组成骨细胞体积相对小，内质网及线粒体不发达，骨胶原纤维排列较乱，D组成骨细胞内内质网及线粒体少见，胶原纤维粗细不一。第8周及12周时，A、B、C三组可见胶原纤维与骨小梁并行排列，可见周期性横纹，且A组成骨细胞及细胞核体积大，核膜完整；B、C组细胞器较A组欠丰富，D组胶原纤维较多，直径较粗。

3 讨论

成骨细胞分泌骨基质，并参与骨基质及骨钙的代谢，其增殖能产生丰富的胶原，是骨形成过程中的主要功能细胞[1]。骨小梁的结构和骨强度密切相关，骨小梁的生成量与排列结构是判断骨折愈合与否的重要参考指标。研究表明[2]，骨小梁的微观结构决定骨强度。本研究观察了模型兔骨缺损区新生骨痂成骨细胞数量、微观结构及骨小梁的体积、排列，上述指标可以很好的反映缺损区骨组织的新生能力以及骨折愈合情况。

高压氧治疗是指在比大气压高的气压环境下吸入纯氧，增加血液中的溶解氧量，进而改善症状和治疗疾病。高压氧治疗骨缺损的主要机制有：①高压氧通过增加血氧含量，改善骨折端组织的缺氧状态。②高压氧治疗能促进新生毛细血管的生成，降低全血黏度及血浆黏度，增加缺损区血液供应，从而促进骨组织的生长[3]。③高压氧还可以通过增强成骨细胞和破骨细胞的增殖、分裂，加速骨膜下骨样组织的生长从而促进骨再生[4]。④此外，高压氧还可以通过诱导骨髓间充质细胞分化来治疗骨缺损[4]。

仙桃草又名接骨草。是一种广泛应用于骨科领域的中草药，其主要有效成份包括木犀草素、金圣草素、原儿茶酸、香草酸、甘露醇、绿原酸等[5,6]。木犀草素对抗氧自由基的活性与表达，能明显促进血管内皮损伤的修复，在骨组织修复过程中可能起着重要作用[7，8]。香草酸及其受体对骨代谢及成骨细胞分泌骨保护蛋白中起着重要的调控作用[9,10]。原儿茶酸不仅具有较强的抗氧化功能，而且能促进人脂肪干细胞体外增殖分化为成骨细胞[11]。

本研究发现，高压氧联合仙桃草饲喂治疗兔骨缺损，与单用高压氧和仙桃草饲喂者相比，新生骨痂成骨细胞计数高，骨小梁生长快。高压氧能促进新生毛细血管的生成，但新生毛细血管内皮细胞发育并不成熟，细胞通透性高，液体渗出较多，可影响和压迫局部的血运和抑制骨细胞生长，而仙桃草中的主要成分之一木犀草素不仅能缓解高压引起的血运障碍，而且能促进血管的成熟。此外，仙桃草中还含有一定含量的甘露醇[5,6]，甘露醇具有明显的脱水作用，可减轻高压氧治疗所引起新生毛细血管周围的高渗高压状态，减轻水肿对血管的压力，从而改善微循环血流量。研究[12]发现，仙桃草中的原儿茶酸分子结构中的邻二酚羟基为体外清除自由基的活性部位，同时有羧基时能明显增强促血管新生的活性，而高压氧可通过提高血氧含量，促进原儿茶酸分子羟基向羧基的转化。因此，仙桃草饲喂除了本身的药物治疗作用以外，还能弥补高压氧治疗时所存在的不足。另外高压氧能提高组织内氧含量，增强细胞活性，因而有利于仙桃草中的有效成分进入细胞内并在胞内发挥效应。此外，高压氧可以降低由激素引起的全血粘度及血浆黏度，使血流通畅，这将有利于仙桃草中的有效成分迅速到达骨缺损部位，从而使药物发挥其最大作用。其具体机制有待进一步证实。

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2016-08-25)