MMP-9基因-1562C/T变异与吸烟的交互作用对颈动脉易损斑块的影响

蒋健刚 兰景良 王晓华 杜晓马

MMP-9基因-1562C/T变异与吸烟的交互作用对颈动脉易损斑块的影响

蒋健刚 兰景良 王晓华 杜晓马

目的 探讨MMP-9基因-1562C/T位点变异与颈动脉易损斑块的关系，及基因多态性和吸烟在颈动脉易损斑块易感性中的交互作用。方法 358例符合纳入标准的患者根据颈动脉超声分为易损斑块组（122例）和稳定斑块组（236例）。采用PCR-RFLP方法检测两组-1562C/T位点基因型，比较两组基因型及等位基因频率分布差异，应用相加模型分析-1562C/T变异与吸烟对易损斑块的交互作用。 结果 易损斑块组携带T等位基因频率（20.90%）明显高于稳定斑块组（11.65%）（χ2=10.91，P＜0.01），易损斑块组的吸烟率也明显高于稳定斑块组（χ2=9.74，P＜0.01）。T等位基因和吸烟对易损斑块交互作用的定性分析显示，相对于不吸烟且携带CC基因型个体，吸烟OR=1.56（P＜0.05），T等位基因OR=1.67（P＜0.05），同时吸烟又携带T等位基因OR=3.60（P＜0.01），吸烟与T等位基因存在正相加模型交互作用。多元logistic回归分析显示：控制年龄、性别、BMI、血压、HbA1C和LDL-C等因素后，MMP-9基因-1562C/T变异T等位基因与吸烟的协同作用指数为2.12，归因交互效应为1.36，归因效应为37.78%，纯因子间交互作用为52.30%。 结论 MMP-9基因-1562C/T变异与吸烟对颈动脉易损斑块的影响存在协同交互作用；对于携带T等位基因并吸烟的个体，尽早戒烟可能可以降低发生颈动脉易损斑块的风险。

颈动脉易损斑块 基因多态性 基质金属蛋白酶-9 吸烟 交互作用

近年来，随着老龄化社会的到来及人们生产生活方式的改变，心脑血管疾病发病率和致残、致死率都有了明显的上升。动脉发生粥样硬化是心脑血管疾病发生的病理学基础，颈动脉因其具有位置表浅、走向平直、易于检测等优点，而通常被作为反应全身动脉硬化程度的一个窗口，颈动脉易损斑块可能与严重心脑血管事件密切相关[1]。研究表明：血浆基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9）水平在动脉粥样斑块的发生、发展中发挥重要作用，而其编码基因也被认为与许多心脑血管疾病有重要关联[2]。众所周知，吸烟也是动脉发生粥样硬化的重要危险因素，但目前尚未见有关MMP-9基因变异和吸烟对颈动脉易损斑块交互作用的相关报道。本文将这一问题作初步的研究，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2014年5月至2016年5月在我院体检和就诊的颈动脉斑块患者358例。根据颈动脉彩超结果[3]，将斑块为无回声和低回声的122例纳入易损斑块组，男73例，女49例，年龄43～77（63.74±9.36）岁。提示为强回声的236例为稳定斑块组，男134例，女102例，年龄41～76（63.28±10.14）岁。两组对象性别、年龄差异均无统计学意义（均P＞0.05）。所有研究对象均为中国浙江金华地区汉族常住人口，彼此间无任何血缘关系。排除标准：除外近1年内发生过脑卒中、颅内感染、心肌梗死、心房纤维性颤动、心瓣膜病、动脉瘤、严重肝肾功能不全、各种血液病、风湿免疫性疾病、各种传染病、慢性炎症性疾病、肿瘤、妊娠及非自愿参加者。本研究通过医院伦理委员会审批，全部研究对象均为自愿参加并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 颈动脉彩超检查 颈动脉彩超检测由2位高年资超声诊断科医师独立操作完成，取两者检测结果一致的患者入组。分别检测每例患者的双侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）和CCA分叉处，而颈内动脉颅外段则用纵轴实时二维图像进行测量。舒张末期时测量3处（CCA分叉处近端1cm、CCA分叉处及颈内动脉起始段1cm）后壁的内膜厚度（intima-media thickness，IMT），每侧各测量3次，取3次的平均值。参照Mathiesen等[3]的方法及标准来确定彩超检查方法及分类标准。以颈动脉稳定斑块为病情稳定的参考标准，在本研究中作阴性对照（稳定斑块组）；以易损斑块作为病情进展的诊断标准，在本研究中视为观察对象（易损斑块组）。

1.2.2 吸烟的标准[4]近1年来，每天至少吸1支烟或每周吸烟超过7支。

1.2.3 采集标本 所有研究对象均在第2天抽取清晨空腹肘静脉血5ml，其中3ml用于临床生化指标测定，另外2ml置于EDTA抗凝管中，用于提取基因组DNA。

1.2.4 MMP-9基因-1562C/T位点变异检测 （1）基因组DNA提取：用酚-氯仿经典方法提取外周血基因组DNA，并置于-20℃保存备用。（2）PCR扩增：引物设计参考文献[5]：P1:5′-GCC TGG CAC ATA GTA GGC CC-3′；P2：5′-CTT CCT AGC CAG CCG GCA TC-3′。PCR反应体系为50μl：10×buffer 5μl、上下游引物各1μl、dNTPs（10mmol/L）2μl、基因组DNA 2μl、Taq plus DNA聚合酶2μl和ddH2O 37μl。PCR反应条件为95℃4min；95℃30s、55℃45s、72℃45s，进行35个循环；72℃7min。结束后取2μl反应产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行EB电泳检测确认。（3）PCR产物酶切：酶切反应体系为：PCR产物 5.0μl：PaeⅠ内切酶 1U、10×酶切缓冲液1.0μl、ddH2O补足总体积至10.0μl；37℃水浴16h。（4）基因型辨别：取3.0μl酶切产物上样，用2.5%的琼脂糖凝胶进行电泳（100V，30min），电泳后在紫外凝胶成像仪下拍照，根据酶切产物片段的组合型来判断基因型。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因的组间比较采用χ2检验。计量资料以表示，符合正态分布在两组间比较采用t检验。MMP-9基因-1562C/T变异与吸烟交互作用分析选用相加模型，OR计算及混杂因素的控制采用logistic回归分析。

2 结果

2.1 MMP-9基因-1562C/T变异和吸烟与易损斑块的关系

2.1.1 MMP-9基因-1562C/T位点基因型检测结果 （1）PCR扩增结果：扩增目标片段为435bp（见图1）。（2）PCR酶切结果：根据酶切后片段组合分为3种。野生型纯合子（基因型C/C）不能被酶切，表现为一条长度为435bp的单条带；突变型纯合子（基因型T/T）完全被酶切，表现为长度为247bp和188bp的双条带；突变型杂合子（基因型C/T）部分被酶切，表现为长度为435、247和188bp的三条带（见图2）。

2.1.2 吸烟与易损斑块的关系 易损斑块组吸烟率为43.44%（53/122），高于稳定斑块组的27.12%（64/236），两组对象吸烟率比较差异有统计学意义（χ2=9.74，P＜0.01）。

2.1.3 MMP-9-1562C/T变异与易损斑块的关系 易损斑块组和稳定斑块组MMP-9-1562C/T基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=1.52、0.92，P=0.22、0.34）。两组对象的基因型及等位基因分布频率差异见表1。

图1 MMP-9基因-1562C/T位点PCR扩增电泳图（泳道1、2、3、4、5、6为扩增产物，泳道N为空白对照，M为Marker）

图2 MMP-9基因-1562C/T位点PCR扩增后酶切电泳图（泳道1为空白对照，泳道2和3为C/C型，泳道4为T/T型，泳道5、6、7为C/T型，M为Marker）

表1 两组对象基因型及等位基因分布频率差异[例（%）]

由表1可见，两组对象基因型分布差异有统计学意义（P＜0.01），易损斑块组T等位基因分布频率明显高于斑块稳定组（P＜0.01）。

2.2 MMP-9基因-1562C/T变异T等位基因和吸烟对易损斑块的交互作用

2.2.1 T等位基因和吸烟对易损斑块交互作用的定性分析 以是否是易损斑块为因变量（易损斑块=1，稳定斑块=0），以是否携带T等位基因和吸烟为自变量，进行非条件logistic回归分析，具体见表2。

表2 T等位基因与吸烟对易损斑块交互作用的定性分析

由表2可见，相对于不吸烟且携带CC基因型个体，吸烟OR=1.56（P＜0.05），T等位基因OR=1.67（P＜0.05），同时吸烟又携带T等位基因OR=3.60（P＜0.01），后者的OR值大于前两者OR值减去1后的相加值，吸烟与T等位基因存在正相加模型交互作用。控制性别、年龄、BMI、血压、HbA1C、LDL-C等混杂因素后，吸烟OR=1.12（P＜0.05），T等位基因OR=2.61（P＜0.05），两者联合作用的OR=2.61（P＜0.01），吸烟与T等位基因仍具有正交互作用。

2.2.2 T等位基因和吸烟对易损斑块交互作用的定量分析 控制混杂因素前，吸烟与T等位基因交互作用的协同效应指数为2.12，归因效应为1.36，归因交互效应为37.78%，纯因子间归因交互效应为52.30%，控制混杂因素后，以上指数分别为3.04、1.08、41.36%和67.01%。

3 讨论

多年来人们通常将颈动脉管腔狭窄的严重程度作为评判动脉粥样硬化进展程度的标准，且根据这一标准来判断是否需要进行临床干预。然而，有研究证实这个认识是狭隘的，该研究发现发生缺血性事件的主要影响因素是动脉粥样斑块的稳定性而不是管腔狭窄的严重程度，即对患有颈动脉粥样硬化患者影响最大的因素是斑块的质而不是量，导致缺血性事件发生的直接元凶是斑块的易损性[6]。Naghavi等[7]指出易损斑块的主要特点就是斑块纤维帽薄、核心内有大量的脂质坏死物。

动脉粥样硬化斑块是引起冠状动脉粥样硬化性心脏病的病理学基础，MMP是内源性锌依赖性酶家族的一员，是基质降解的重要调节因子，在维持血管稳定性和完整性方面发挥重要作用，与动脉粥样硬化程度密切相关[1-2]。MMP-9基因-1562C/T是MMP-9基因转录启动子上游1 562位点处的一个重要调控元件，该位点发生C→T变异后，将明显影响血浆MMP-9表达[8]。研究发现[8]：该基因位点发生C→T变异的个体发生冠心病的风险较未发生变异者明显升高，T等位基因可能明显增加心肌梗死的发病风险。在本研究中单因素研究结果显示，易损斑块组的T等位基因频率为20.90%，明显高于稳定斑块组的11.65%，差异有统计学意义（P＜0.01），提示 T等位基因可能与颈动脉斑块易损性严重相关（OR=1.67），这与董翔等[9]的研究结果相类似。

研究表明，吸烟是引起动脉粥样硬化斑块不稳定的独立危险因素[10]。王振东等[11]研究发现，吸烟可能是急性心肌梗死最主要的危险因素之一。在本研究中单因素研究结果显示，易损斑块组的吸烟率明显高于稳定斑块组，提示吸烟可能与颈动脉斑块的不稳定性密切相关，吸烟可能是颈动脉斑块发生易损的重要危险因素之一（OR=1.56）。

本研究对MMP-9基因-1562C/T变异与吸烟的交互作用分析结果显示，两者协同效应指数在控制混杂因素前后分别为2.12和3.04，纯因子归因交互效应百分比分别为52.30%和67.01%，说明无论是否控制混杂因素，两者均存在协同交互作用，在仅仅由这两个因素所致的斑块发生易损的危险性中，扣除本底效应后由交互作用所产生的危险性占52%～67%，说明两者间交互作用强。因此认为在携带-1562C/T变异T等位基因的个体中，戒烟可降低颈动脉斑块发生易损的危险性，从而降低冠心病等心脑血管疾病的发病风险。但本研究受地域限制、纳入样本少、对斑块稳定性的评判标准不是非常客观及需要排除的混杂因素多等因素影响，结果可能会和实际情况有些差别，需要更进一步的深入研究。

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Interaction of MMP-9 gene-1562C/T mutation with smoking on susceptibility of instable carotid plaques

JIANG Jiangang,LAN Jingliang,WANG Xiaohua,et al.Department of Cardiovascular,Jinhua TCM Hospital,Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Jinhua 321017,China

Objective To investigate the relationship between polymorphism of MMP-9 gene-1562C/T and susceptibility of instable carotid plaques. Methods Total 358 patients with ultrasonic diagnosed-carotid plaques were enrolled in the study, including 122 cases with instable carotid plaques(instable group)and 236 cases with stable carotid plaques(stable group).The MMP-9 genotypes were detected by PCR-RFLP.Chi-square test was used to compare the distribution of the genotype and allele frequency between two groups.And the interaction of-1562C/T mutation with smoking on susceptibility of instability of carotid plaques was analyzed using additive model. Results The frequency of CT and TT genotypes in carotid instable group was significantly higher than that in the stable group(20.90%vs.11.65%,χ2=10.91,P＜0.01),and the frequency of smoking was also higher(χ2=9.74,P＜0.01).The qualitative analysis of interaction showed that compared to non-smokers carrying CC genotype,the OR value of smoker was 1.56(P＜0.05),the OR value of carrying T allele was 1.67(P＜0.05)and that of smokers carrying T allele was 3.60(P＜0.01),there was an additive interaction between smoking and T allele.Multiple logistic regression showed that after adjusting the gender,age,BMI,blood press,HbA1c and LDL-C,there was a positive interaction between T allele and smoking on instability of carotid plaques.The synergy index of 2.12,the attributable interaction index of.36;the attributable interaction percentage was 37.78%,and pure attributable interaction percentage was 52.30%. Conclusion There is a synergy between the-1562C/T mutation of MMP-9 gene and smoking on instability of carotid plaques.The study indicates that for smokers carrying the T allele to quit smoking may decrease the risk of instability of carotid plaques.

Carotid vulnerable plaque Gene polymorphisms Matrix metalloproteinase-9 Smoking Interaction

2016-11-23）

（本文编辑：沈昱平）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.7.2016-1763

321000 金华，浙江中医药大学附属金华市中医院心内科