中国西南地区汉族人群PRSS1基因多态性与慢性胰腺炎的关系

朱雨田，姚伍秀，汪洋，严茂林，陈和平

(1电子科技大学附属医院·四川省人民医院，成都610072；2电子科技大学医学院)

中国西南地区汉族人群PRSS1基因多态性与慢性胰腺炎的关系

朱雨田1,2，姚伍秀1，汪洋1,2，严茂林1，陈和平1,2

(1电子科技大学附属医院·四川省人民医院，成都610072；2电子科技大学医学院)

目的 探讨中国西南地区汉族人群中阳离子胰蛋白酶原(PRSS1)基因单核苷酸多态性(SNP)与慢性胰腺炎(CP)的关系。方法 收集西南地区汉族人群样本864例，其中确诊CP患者384例(CP组)，体检健康者480例(对照组);选取PRSS1基因rs10273639、rs6667和rs2011216 3个位点，采用单碱基延伸法检测SNP位点，分析其与CP的相关性。结果 rs6667位点G等位基因频率在CP组和对照组中分别为37.8%、29.8%，GG基因型频率分别为14.1%、7.5%，两组比较P均<0.05；rs2011216 位点G等位基因频率在CP组和对照组中分别为33.2%、26.5%，GG基因型频率分别为10.4%、6.0%，两组比较P均<0.05； rs10273639等位基因及基因型在CP组与对照组比较差异无统计学意义。二元Logistic回归分析，rs6667位点G等位基因携带者患CP的风险是A等位基因的1.18倍，在显性模式[(AG+GG)vsAA] 和隐性模式[GGvs(AG+AA)]下CP组患病风险分别是对照组的1.18、1.76倍；rs2011216 位点G等位基因携带者患CP的风险是A等位基因的1.16倍，在显性模式[(AG+GG)vsAA]和隐性模式[GGvs(AG+AA)] 下CP组患病风险分别是对照组的1.17、1.34倍；rs10273639位点下显性模式[(TC+CC)vsTT]和隐性模式[CCvs(TC+TT)]在CP组与对照组比较差异均无统计学意义。结论 PRSS1基因rs6667和rs2011216的SNP位点可能是中国西南地区汉族人群CP的易感基因位点。

慢性胰腺炎；阳离子胰蛋白酶原；单核苷酸多态性；汉族；中国西南地区

研究显示，慢性胰腺炎(CP)是一种由遗传因素与环境因素共同作用的多因素疾病。阳离子胰蛋白酶原(PRSS1)基因，亦称丝氨酸蛋白酶1基因，是编码丝氨酸蛋白酶家族中的一种胰蛋白酶原。其由胰腺分泌进入小肠，并在肠激酶的激活下转换为胰蛋白酶[1,2]。PRSS1基因功能获得性突变，可以通过改变胰蛋白酶识别位点来阻止胰蛋白酶的失活，从而延续其活性，导致CP的患病风险大大增加[3]。国外已有2篇全基因组关联研究(GWAS)[4,5]发现，PRSS1基因单核苷酸多态性(SNP)位点与CP具有显著相关性，而目前国内尚未见PRSS1基因SNP与CP相关关系的报道。鉴于疾病的遗传和表型在不同人种和地区有较大异质性，以及SNP位点最小等位基因频率(MAF)的分布在不同人种中也存在差异，故在进行群体关联研究相关基因或位点时,应在不同地区及人种中进一步验证。因此，本研究通过应用单碱基延伸法(SNaPshot)法对384例CP患者和480例健康对照者PRSS1基因rs10273639、rs6667和rs2011216 3个SNP位点进行基因分型，探讨西南地区汉族人群PRSS1基因与CP的关联性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集中国西南地区汉族人群样本864例，其中2010年10月～2016年6月在四川省人民医院和四川省人民医院崇州分院确诊的CP患者384例(CP组)，同期健康体检者480例(对照组)。CP组中男242例、女142例，年龄(55.46±17.91)岁，诊断符合2014年由中华医学会外科学分会胰腺外科学组制定的《慢性胰腺炎诊治指南》[6]，均排除肿瘤、高血压、代谢性疾病、自身免疫性疾病等基础疾病。对照组中男295例、女185例，年龄(54.42±18.95)岁，均体检健康，无胰腺疾病及其他遗传病。两组均无亲缘关系，且性别、年龄和地域分布具有可比性。本研究经四川省人民医院伦理委员会批准，全部调查和取样均征得受试者同意并签署知情同意书。

1.2 PRSS1基因多态性检测方法

1.2.1 基因组DNA提取 抽取每位研究对象外周静脉血(EDTA抗凝)4 mL，采用基因组DNA小量抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)提取静脉血白细胞基因组DNA，并溶解于TE缓冲液中。NanoDrop 2000检测DNA浓度和纯度后，将DNA工作液校正至50 ng/μL，于-20 ℃保存备用。

1.2.2 PRSS1基因SNP位点的选择 选取的PRSS1基因SNP位点信息来源于美国国立生物技术信息中心(NCBI)dbSNP，以连锁不平衡(LD)相关系数r2>0.8、MAF>0.1为选择标准，并结合现有国内外研究结果，研究较多的是rs10273639、rs6667、rs2011216、rs1985888、rs9969188、rs4726576；参考hapmap数据库(http://www.hapmap.org)中汉族人PRSS1基因信息，选取其中有阳性意义的rs10273639、rs6667和rs2011216 3个SNP位点进行检测。

1.2.3 目的片段扩增 从UCSC基因组数据库网站(http://genome.ucsc.edu/index.html)检索SNP序列，引物设计使用Primer 3.0在线软件，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增反应采用MyCycler Thermal Cycler扩增仪(美国Bio-Rad公司)。PCR循环条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共进行35个循环；最后72 ℃延伸7 min，12 ℃保温。DNA浓度为50 ng/μL，引物浓度为1 μmol/L。PRSS1基因SNP位点引物序列，见表1。

表1 PRSS1基因SNP位点引物序列

1.2.4 基因分型 采用SNaPshot法。6 μL的PCR产物(rs10273639、rs6667和rs2011216扩增产物各2 μL混合)中加入1 U碱性磷酸酶 (FastAP，美国Promega公司)以及1 U核酸外切酶(Exo I酶，英国Biolabs公司)混匀，37 ℃ 30 min、80 ℃ 15 min进行PCR产物纯化。取纯化混合产物2 μL，分别加入SNaPshot引物各0.2 μL，SNaPshot®RMultiplex试剂(美国ABI公司)1 μL，最后用ddH2O补足至5 μL。荧光PCR反应条件：96 ℃预变性1 min；96 ℃变性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，共进行25个循环；12 ℃保温。最后吸取1 μL上述反应产物后加入10 μL ddH2O混匀，放入ABI3130型测序分析仪(美国ABI公司)检测基因型，利用Gene Mapper4.0软件进行基因型的判定和数据的收集整理。结果判读：根据检测到不同颜色的荧光信号来判断碱基种类，从而确定样本基因型。绿色代表碱基A、蓝色代表碱基G、红色代表碱基T、黑色代表碱基C，单峰表示基因型纯合，双峰表示基因型杂合。为确保分型结果的准确性，随机选取5%的样本通过直接测序法进行验证。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。两组人群基因型频数均行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，两组SNPs位点基因型和等位基因频率比较采用χ2检验；采用二元Logistic回归分析等位基因及遗传模型(显性模式和隐性模式)与疾病的关系，并用比数比(OR)及其95%可信区间(95%CI)表示。P<0.05为差异有统计学意义。显性模式 =(mm+Mm)/ MM，隐性模式=(Mm+MM)/mm。m为次要等位基因，M为主要等位基因。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果 所选PRSS1基因3个SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P均>0.05)，说明样本具有群体代表性。

2.2 PRSS1基因SNPs位点基因型和等位基因分布情况 rs6667位点G等位基因频率在CP组和对照组中分别为37.8%、29.8%，GG基因型频率分别为14.1%、7.5%，两组比较P均<0.05；rs2011216 位点G等位基因频率在CP组和对照组中分别为33.2%、26.5%，GG基因型频率分别为10.4%、6.0%，两组比较P均<0.05； rs10273639等位基因及基因型在CP组与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 两组PRSS1基因SNPs位点基因型和等位基因分布情况

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3 PRSS1基因SNPs位点与CP的关系 二元Logistic回归分析，rs6667位点G等位基因携带者患CP的风险是A等位基因的1.18倍(P=0.014，95%CI为1.03～1.35)，在显性模式[(AG+GG)vsAA] 和隐性模式[GGvs(AG+AA)]下CP组患病风险分别是对照组的1.18倍(P=0.006，95%CI为1.05～1.33)、1.76倍(P=0.000，95%CI为1.44～2.15)；rs2011216 位点G等位基因携带者患CP的风险是A等位基因的1.16倍(P=0.034，95%CI为1.00～1.33)，在显性模式[(AG+GG)vsAA]和隐性模式[GGvs(AG+AA)]下CP组患病风险分别是对照组的1.17倍(P=0.009，95%CI为1.04～1.32)、1.34倍(P=0.018，95%CI为1.10～1.66)；rs10273639位点下显性模式[(TC+CC)vsTT]和隐性模式[CC vs(TC+TT)]在CP组与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

3 讨论

CP是一种进展性且不可逆转的胰腺炎症性疾病，长期的慢性炎症刺激增加罹患胰腺癌的概率[7,8]。研究表明，CP是遗传因素和环境因素交互作用的结果[2]，以基因突变和SNP为标记的关联研究可以提示疾病的遗传易感性，有助于CP发病机制的阐明和发现高危人群。

PRSS1基因是第一个确定的CP易感基因[9]，相继在德国人群、法国人群、印度人群中验证了PRSS1基因多态性与CP存在关联[4,5, 10]。PRSS1基因定位在常染色体7q34，包含7个外显子，目前已被发现的SNP位点有1 055个。该基因可编码一种胰蛋白酶原，其作用是水解食物中含赖-精氨酸残基的蛋白质，同时在激活或灭活其他消化酶的过程中起关键作用[11]。PRSS1基因异常将导致胰蛋白酶原过度催化并转化成胰蛋白酶，引起腺泡细胞损伤或自溶，从而导致胰腺导管和间质受损[12],最终演变成慢性胰腺炎或胰腺疾病。在中国的一个遗传性胰腺炎家系中发现， PRSS1基因3号外显子区136位碱基的C→T杂合性突变可能与该病有关[13]；但是，Chandak等[14]的研究表明,在印度人群中PRSS1基因与CP的发病无关。这些不一致的研究结果表明,基因与疾病关联的异质性与地区、人种等存在密切的关系。

本研究采用病例-对照法,探讨西南地区汉族人群PRSS1基因多态性与CP的关联性,两组中检测的各多态性基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡检验，表明该样本在一定程度上能较好地代表中国汉族人群的遗传学特征。结果显示，PRSS1基因rs6667和rs2011216位点GG基因型分布和G等位基因频率在CP组和对照组比较差异有统计学意义，且两组rs6667和rs2011216位点在显性模式及隐性模式下差异同样具有统计学意义，表明rs6667和rs2011216可能与中国西南汉族人群CP的发生存在相关性，与德国人群[15]中的研究结果一致。既往诸多研究[16～19]表明，同义突变虽然不改变蛋白的性状，但可以影响蛋白的表达和功能。其机制包括：①同义突变改变mRNA的碱基组成，导致mRNA的二级结构发生变化，从而影响mRNA结构的稳定性；②同义突变有可能产生新的隐藏剪接位点或者影响调控元件，如沉默子、外显子剪接增强子等，从而导致mRNA剪接的异常；③同义突变可以影响翻译速率。rs6667和rs2011216位点均是PRSS1基因上的同义突变，很可能在一定程度上影响了PRSS1基因的蛋白表达水平，引起胰蛋白酶活性的改变，从而导致CP的发生。Whitcomb等[4]研究发现，携带rs10273639 T等位基因(CT+TT)的个体对于CP的易感性要显著低于携带CC基因型的个体，但本研究结果显示rs10273639与中国西南地区汉族CP无关，这可能是由于该位点基因型存在种族差异性。另外Boulling等[20]运用荧光素酶报告基因检测的方法证实，是rs4726576的A等位基因在PRSS1-PRSS2基因中起到保护作用，而不是rs10273639的T等位基因，有待后续实验进一步验证。

总之，本研究结果初步验证了PRSS1基因rs6667和rs2011216的SNP位点是中国西南汉族人群的易感基因位点，对后续的功能研究提供了理论依据；但本研究存在一定局限性，如样本量较小、仅限于汉族人群，后续研究尚需扩大样本量并收集多民族样本，以进一步明确PRSS1基因多态性在CP遗传易感性中的作用。

[1] Boulling A, Abrantes A, Masson E, et al. Discovery and functional annotation of PRSS1 promoter variants in chronic pancreatitis[J]. Hum Mutat, 2016,37(11):1149-1152.

[2] Ravi KV, Nageshwar RD. Genetics of acute and chronic pancreatitis: An update[J]. World J Gastrointest Pathophysiol, 2014,5(4):427-437.

[3] Witt H, Luck W, Becker M. A signal peptide cleavage site mutation in the cationic trypsinogen gene is strongly associated with chronic pancreatitis[J]. Gastroenterology, 1999,117(1):7-10.

[4] Whitcomb DC, LaRusch J, Krasinskas AM, et al. Common genetic variants in the CLDN2 and PRSS1-PRSS2 loci alter risk for alcohol-related and sporadic pancreatitis[J]. Nat Genet, 2012,44(12):1349-1354.

[5] Derikx MH, Kovacs P, Scholz M, et al. Polymorphisms at PRSS1-PRSS2 and CLDN2-MORC4 loci associate with alcoholic and non-alcoholic chronic pancreatitis in a European replication study[J]. Gut, 2015,64(9):1426-1433.

[6] 中华医学会外科学分会胰腺外科学组.CP诊治指南(2014)[J].中国实用外科杂志,2014,35(3):277-282.

[7] Yadav D, Lowenfels AB.The epidemiology of pancreatitis and pancreatic cancer[J]. Gastroenterology, 2013,144(6):1252-1261.

[8] Pinho AV, Chantrill L, Rooman I. Chronic pancreatitis: a path to pancreatic cancer[J]. Cancer Lett, 2014,345(2):203-209.

[9] Whitcomb DC, Gorry MC, Preston RA, et al. Hereditary pancreatitis is caused by a mutation in the cationic trypsinogen gene[J]. Nat Genet, 1996,14(2):141-145.

[10] Avanthi SU, Ravi Kanth VV, Agarwal J, et al. Association of claudin2 and PRSS1-PRSS2 polymorphisms with idiopathic recurrent acute and chronic pancreatitis: A case-control study from India[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2015,30(12):1796-1801.

[11] Rygiel AM, Beer S, Simon P, et al. Gene conversion between cationic trypsinogen (PRSS1) and the pseudogene trypsinogen 6 (PRSS3P2) in patients with chronic pancreatitis[J]. Hum Mutat, 2015,3(36): 350-356.

[12] Sahin-Toth M, Toth M. Gain-of-function mutations associated with hereditary pancreatitis enhance autoactivation of human cationic trypsinogen[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000,278(2):286-289.

[13] 刘奇才,程祖建,杨艳,等.一个遗传性胰腺炎家系中新发现的胰蛋白酶原基因突变[J]. 遗传,2007,29(9):1067-1070.

[14] Chandak GR, Idris MM, Reddy DN, et al. Absence of PRSS1 mutations and association of SPINK1 trypsin inhibitor mutations in hereditary and non-hereditary chronic pancreatitis[J]. Gut, 2004,53(5):723-728.

[15] Krehan M, Ruffert C, Kistner S, et al. PRSS1 variants rs10273639, rs4726576, rs6667 and rs2011216 contribute to chronic pancreatitis risk by elevating PRSS1 mRNA[J]. Gastroenterology, 2016,3(16):1492.

[16] Hunt RC, Simhadri VL, Iandoli M, et al. Exposing synonymous mutations[J]. Trends Genet, 2014,30(7):308-321.

[17] Coulgeans CD, Silvy M, Halverson G, et al. Synonymous nucleotide polymorphisms influence Dombrock blood group protein expression in K562 cells[J]. Br J Haematol, 2014,164(1):131-141.

[18] Griseri P, Bourcier C, Hieblot C, et al. A synonymous polymorphism of the Tristetraprolin (TTP) gene, an AU-rich mRNA-binding protein, affects translation efficiency and response to Herceptin treatment in breast cancer patients[J]. Hum Mol Genet, 2011,20(23):4556-4568.

[19] Bartoszewski RA, Jablonsky M, Bartoszewska S, et al. A synonymous single nucleotide polymorphism in DeltaF508 CFTR alters the secondary structure of the mRNA and the expression of the mutant protein[J]. J Biol Chem, 2010,285(37):28741-28748.

[20] Boulling A, Sato M, Masson M, et al. Identification of a functional PRSS1 promoter variant in linkage disequilibrium with the chronic pancreatitis protecting rs10273639[J]. Gut, 2015,64(11):1837-1838.

Association between PRSS1 gene polymorphism and chronic pancreatitis in southwestern Chinese Han population

ZHUYutian1,YAOWuxiu,WANGYang,YANMaolin,CHENHeping

(1SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople'sHospital,Chengdu610072,China)

Objective To investigate the association between PRSS1 single nucleotide polymorphism (SNP) and chronic pancreatitis (CP) in southwestern Chinese Han population. Methods Genomic DNA was prepared from 384 individuals with CP (CP group) and 480 healthy controls (control group). Three SNPs in the PRSS1 gene (rs10273639, rs6667 and rs2011216) were selected by case-control study. The SNPs were detected by single-base extension method and their correlation with CP was analyzed.Results All three SNPs conformed to Hardy-Weinberg equilibrium (allP>0.05). The G allele frequencies of rs6667 and rs2011216 were 37.8%, 33.2%, 29.8% and 26.5% in the CP group and control group, respectively. The GG genotype frequencies were 14.1%, 10.4%, 7.5% and 6.0% (allP<0.05). The allele and genotype of rs10273639 had no significant difference between the CP group and control group (allP>0.05). Binary logistic regression analysis showed that the risk of CP in rs6667 G allele was 1.18 times more than that in A allele, while in the dominant model [(AG+GG) vs AA] and recessive model [GG vs (AG+AA)] it was 1.18-fold and 1.76-fold higher in CP group than that of the control group, respectively. In the risk of developing CP, rs2011216 G allele carriers were1.16 times as high as the A allele carriers. In the dominant model [(AG + GG) vs AA] and recessive model [GG vs (AG + AA)], the risk of CP group was 1.17 times and 1.34 times higher than that of the control group, respectively. In addition, rs10273639 was not associated with CP susceptibility (P>0.05). Conclusion The rs6667 and rs2011216 loci of the PRSS1 gene may be associated with chronic pancreatitis among southwestern Chinese Han population.

chronic pancreatitis; PRSS1 gene; single nucleotide polymorphism; Han nationality; southwest of China

四川省干部保健科研基金(川干研2016-203);四川省科技厅基金资助项目(2011FZ0036)；四川省人民医院青年基金(2015QN19)。

朱雨田(1993-)，女，硕士研究生，主要研究方向为消化系统疾病的机制。E-mail: zytlessismore@163.com

陈和平(1963-)，男，博士，博士生导师，主任医师，主要研究方向为消化系统疾病的机制。E-mail: doctorchenhp@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.006

R394.3

A

1002-266X(2017)10-0020-04

2016-10-24)