化瘀通络灸法对VD大鼠血管内皮细胞增殖迁移变化的影响

张曼,杨骏,王萍,王频



化瘀通络灸法对VD大鼠血管内皮细胞增殖迁移变化的影响

张曼1,杨骏1,王萍2,王频1

(1.安徽中医药大学,合肥 230038;2.安徽中医药大学第一附属医院,合肥 230038)

目的 体外研究观察化瘀通络灸法治疗后,大鼠血清的效应物质干预血管内皮细胞增值、迁移变化的过程,探讨化瘀通络灸法治疗血管性痴呆可能的促血管生成机制。方法 选取Wistar 雄性成年大鼠,采用四血管阻断法(4-VO)制备血管性痴呆的大鼠模型,随机分为艾灸组、西药组、模型组,并设假模型组对照,共4组。艾灸组取百会隔附子饼灸,大椎、神庭穴悬灸治疗,西药组以茴拉西坦灌胃,15 d为1个疗程,均为2个疗程。每个疗程结束后,艾灸组、假模型组、模型组大鼠眼眶取血。制备化瘀通络灸法治疗后的动物血清,干预人脐静脉内皮细胞(HUVEC-12)培养过程,另设平行液组,配制含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液。四甲基唑盐比色法(MTT法)检测内皮细胞的增殖,细胞划痕标记法检测内皮细胞的迁移。结果 2个疗程治疗结束后,通过MTT法检测血管内皮细胞增殖,与模型血清组、假模型血清组、平行液组比较,艾灸血清组大鼠血清干预人脐静脉内皮细胞(HUVEC-12)增殖明显(＜0.01)。2个疗程治疗结束后,通过细胞划痕法检测血管内皮细胞迁移,24 h后与模型血清组、假模型血清组、平行液组比较,艾灸血清组大鼠血清干预HUVEC-12的迁移率升高明显(＜0.01)。结论 化瘀通络灸法在改善血管性痴呆大鼠血管内皮细胞增殖、迁移方面的效果明显,从而获取了化瘀通络灸法体外促“血管生成”的有力证据。

痴呆,血管性;内皮细胞;细胞增殖;细胞迁移;血管生成;大鼠;药饼灸疗法;艾条灸;针灸血清

血管性痴呆(vascular dementia,VD)首先由Marie与Binswanger提出,其统一命名是在1992年WHO颁布的《ICD-10精神及行动障碍分类》中。VD是由脑血管疾病导致的认知功能障碍临床综合征,主要表现为高级神经活动的智能障碍,特别是认知功能障碍,包括学习、记忆、思维等障碍,也有失语、失用、失认等神经心理学症状及体征。VD多有卒中史,常表现波动性病程或阶梯式恶化。Craft等研究发现,VD年发生率约3.8%,65岁以上人群中,痴呆的总患病率为8%,其中VD占13%～19%。有研究认为该病的发生与丘脑、海马[1]的缺血性改变有关[2]。同时有国外学者[3]认为,治疗缺血性疾病,应当尽快恢复缺血区血供,挽救濒临死亡的神经胶质细胞、血管内皮细胞、神经元,促血管生成,因此刺激干预促脑内毛细血管生成将成为新的临床治疗方法。本研究通过动物实验的方法,观察化瘀通络灸法对VD大鼠海马血管内皮细胞增殖、迁移变化的影响,探讨化瘀通络灸法治疗血管性痴呆的可能的 “促血管生成”机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与药物

特制的清艾条,规格为10 mm×100 mm,由安徽省天长市寿民灸具厂生产;附子粉由安徽省中医院中草药房提供;茴拉西坦胶囊[Aniracetam Capsule,化学名为1-(4-甲氧基苯酰基)-2-吡咯烷酮]0.1 g×30片/瓶,无锡市凯西药业有限公司生产(批号20090112);水合氯醛由上海国际集团生产(批号20080807); PRMI-1640培养液由GIBCO公司生产(批号981972/ 11875-093);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐-二苯基四氮唑溴盐溶液(MTT)由Sigma公司生产(批号为M2128,TGL-20M);二甲基亚砜(DMSO)由Sigma公司生产(批号20110303661/D5879);高速台式冷冻离心机由长沙湘仪离心机仪器有限公司生产;DTT-2大鼠跳台仪由北京中国中医科学院提供。

1.2 实验动物与分组

SPF级成年雄性Wistar大鼠60只,10月龄,体重(250±50)g,由南京医科大学实验动物中心提供,其许可证号为SCXK(苏)2008-0004。用跳台实验对动物进行筛选,保留48只,然后电脑随机数字表法产生8只作为假模型组,其余大鼠复制血管性痴呆动物模型,模型复制后4 d用跳台实验和神经行为学评分再次筛选出合格痴呆大鼠24只,随机分为艾灸组、西药组、模型组,每组8只。

1.3 造模方法及模型检测

采用改良的Pulsinelli’s四血管阻断动物模型(4-VO)[4],将大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg),腹腔注射麻醉后俯卧位固定,然后常规消毒,首先进行背侧颈正中部位切口,暴露出双侧第一颈椎横突的翼小孔,用直径0.5 mm的电凝针插入烧灼双侧椎动脉,使其永久性闭塞。次日将大鼠仰卧位固定,保持其呼吸通畅,然后腹侧颈正中切口,分离双侧颈总动脉,用无创性动脉夹,可逆性夹闭双侧颈总动脉(CCA)10 min,共夹闭3次,每次间隔10 min。术后手术部位施以适量青霉素抗感染,然后缝合常规饲养观察。假模型组的处理方法与模型组相同,但不阻断颈总动脉(本实验对大鼠有损伤性的操作,得到了相关部门的许可,符合动物研究伦理)。采用跳台实验检测大鼠的学习记忆成绩,训练及测试时将2只大鼠同时分别置于2个隔间内,适应3 min后通以40 V的交流电,持续 5 min,开始测试时将大鼠放在测试箱的平台上,并开始计时,潜伏期为大 鼠第一次跳到铜栅上所需时间,错误次数计算是5 min内从跳下铜栅再跳回平台上的次数,潜伏期和错误次数评价学习成绩,并进行神经行为学的评分。

1.4 治疗方法

艾灸组大鼠固定于自制鼠板上,特制的大鼠头部固定器固定大鼠头部,选取百会、大椎、神庭穴剃毛点记,百会穴隔物灸,穴位上放置制备的直径约15 mm、厚约5 mm附子饼,点燃特制的清艾条,灸火直接灸在附子饼上,穴位皮肤局部出现灼热潮红时立即提起,过后再压灸,反复灸20 min,不出现烫伤;大椎穴、神庭穴于施灸法当天脱毛后用清艾条悬灸20 min。每天1次,15次为1个疗程,共治疗2个疗程,疗程之间休息1 d,常规饲养。西药组采用茴拉西坦灌胃治疗,灌胃剂量为0.0625 mg/g,和蒸馏水混合成0.01 g/mL浓度的溶液,每天1次,疗程与艾灸组同。假模型组和模型组与灸法治疗组平行,只作鼠板上固定而不作其他任何处理。

1.5 神经行为学评分

初次神经行为学评分在模型复制后4 d进行,评分标准按Longa EZ等[5]制定的6级评分法改进,0分为无功能障碍;1分为不能伸展前肢;2分为向一侧旋转;3分为向一侧倾倒;4分为无自主活动伴意识抑制; 5分即死亡。

1.6 血清制备

艾灸血清组把艾灸组大鼠于每个疗程结束后1 h,进行目内眦处取血,每只2mL,离心15 min (3000 r/min),取上层的血清,同组血清混合,56℃、30 min灭活,经0.22mm微孔滤膜过滤除菌,﹣20℃保存备用;假模型血清组和模型血清组血清制备方法与艾灸血清组相同;时间上与之平行。

1.7 人脐静脉内皮细胞株(HUVEC-12)培养和血清干预

将冻于液氮中的HUVEC-12细胞株迅速取出,置于40℃温水中不停摇晃,使其迅速溶解;待溶解后移至净化台内,用移液枪移至离心管内,加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)及5%100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素(双抗液)的RPMI-1640的培养基将其稀释5倍,混匀离心1000 r/min,离心5 min,弃上清液,加入完全培养液(PRMI-1640＋10%胎牛血清＋5%双抗)反复吹打,使其混匀,移至培养瓶中,加入2 mL培养液,置于5%CO2、37℃饱和湿度培养箱培养,待其长至80%融合状态时以0.25%胰酶溶液消化传代。每2～3 d更换培养液或传代1次,取对数期(细胞贴壁,胞浆延展)生长的细胞用于实验。根据干预血清不同,将实验的HUVEC-12细胞株分为4组,分组及培养液中血清添加如下,艾灸血清组,配制含10%化瘀通络灸法大鼠血清的RPMI-1640;模型血清组,配制含10%模型组大鼠血清的RPMI-1640;假模型血清组,配制含10%假造模大鼠血清的RPMI-1640;平行液组,配制含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640。

1.8 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测HUVEC-12的增殖

取对数生长期的HUVEC-12,按2×104接种于96孔板,正常培养24 h后弃去培养液,换上只含有0.5% FBS的细胞培养液预处理24 h以达到细胞同步化;24 h后弃去该细胞培养液,实验按分组更换各组培养液,每组设6个复孔,继续培养20 h后,每孔加入20mL MTT溶液(5 mg/mL),于5%CO2、37℃饱和湿度培养箱继续培养4 h后,吸弃孔内上清液,后加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,)溶液150mL,震荡10 min,在490 nm波长下用全自动酶标仪测定各孔的光密度值(OD)并记录结果。

1.9 细胞划痕法检测HUVEC-12的迁移

取对数生长期的HUVEC-12,以6×104接种于24孔板,每孔400mL。孔板底部预先画好标记线,置于37℃、5% CO2培养箱中培养48 h,待细胞间形成较紧密连接的单层后,用无菌200mL,枪头在培养孔底部中央垂直划一道痕迹(显微镜下可同时看到创面两侧),然后吸出原培养液后用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻吹打划痕附近,倒除培养液,反复3次,将划掉的细胞冲洗干净。然后按分组各孔加入对应培养液400mL,每组设6个复孔。此时在倒置显微镜下摄像(×200),记为0时,然后利用显微尺度选择5个不同视野,分别观察0 h、6 h、24 h后的划痕创面愈合情况。细胞迁移能力以迁移率表示,细胞迁移率(%)=[(原划痕宽度－现划痕宽度)/原划痕宽度]×100%。

1.10 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件处理数据,所有结果采用均数±标准差表示,方差齐性检验后进行单因素方差分析,组间均数的两两比较采用-检验。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模后4 d跳台实验检测及神经行为学检测结果

造模后4 d跳台仪检测大鼠的潜伏期、错误次数并进行神经行为学评分结果见表1。造模组与假造模组的潜伏期、错误次数及神经行为学评分比较均有显著性差异(＜0.01),表明VD大鼠模型制作成功。

表1 造模后4 d潜伏期、错误次数及神经行为学评分检测结果 (±s)

表1 造模后4 d潜伏期、错误次数及神经行为学评分检测结果 (±s)

组别n潜伏期(s)错误次数(次)神经行为学评分(分) 造模组2442.62±9.581)5.4±1.231)2.45±0.761) 假模型组8226.00±43.561.02±0.43-

注:与假模型组比较1)＜0.01

2.2 艾灸效应血清对HUVEC-12细胞增殖影响

经过2个疗程治疗后,艾灸血清组与模型血清组、假模型血清组、平行液组的细胞增殖比较差异有统计学意义(＜0.01),详见表2。表明经过2个疗程治疗后,在增加细胞增殖水平方面,艾灸组有非常显著的效果。由图1可见,艾灸血清组培养的HUVEC增殖能力最强。

表2 细胞增殖的检测结果比较 (±s)

表2 细胞增殖的检测结果比较 (±s)

组别n光密度值(OD) 艾灸血清组60.191±0.0241)3)4) 假模型血清组60.159±0.0062) 模型血清组60.170±0.0065) 平行液组60.161±0.0172)

注:与模型血清组比较1)＜0.01,2)＜0.05;与平行液组比较3)＜0.01;与假模型血清组比较4)＜0.01,5)＜0.05

注:1为艾灸血清组,2为假模型血清组,3为模型血清组,4为平行液组

2.3 艾灸效应血清对HUVEC-12细胞迁移影响

经过2个疗程治疗后,4组间的细胞迁移的检测结果有差异(＜0.05,＜0.01),见表3。0 h各组迁移率没有明显差异(＞0.05);6 h后艾灸血清组与模型血清组、假模型血清组、平行液组的细胞迁移比较差异有统计学意义(＜0.05);24 h后艾灸血清组与模型血清组、假模型血清组、平行液组的细胞迁移比较差异有显著统计学意义(＜0.01)。表明经过2个疗程治疗后,在加快细胞迁移水平方面,艾灸血清组有非常显著的效果。

倒置显微镜(×200)下摄像图片(5～16)显示艾灸动物血清培养的HUVEC迁移能力最强。详见图2。

表3 各组细胞迁移的检测结果 (±s)

表3 各组细胞迁移的检测结果 (±s)

组别n0 h迁移率(%)6 h后迁移率(%)24 h后迁移率(%) 艾灸血清组6049.723±2.3182)4)6)88.689±3.2191)3)5) 假模型血清组6037.950±1.72)52.655±1.6132) 模型血清组6048.443±1.566)61.929±2.2346) 平行液组6038.29±1.4092)55.355±1.6742)

注:与模型血清组比较1)＜0.01,2)＜0.05;与平行液组比较3)＜0.01,4)＜0.05;与假模型血清组比较5)＜0.01,6)＜0.05

注:5～7为艾灸血清组0 h、6 h后、24 h后干预培养的HUVEC迁移表现;8～10为假模型血清组0 h、6 h后、24 h后干预培养的HUVEC迁移表现;11～13为模型血清组0 h、6 h后、24 h后干预培养的HUVEC迁移表现;14～16为平行液组0 h、6 h后、24 h后干预培养的HUVEC迁移表现

3 讨论

《灵枢·海论》提出“脑为髓之海……髓海不足,则脑转耳鸣,胫酸眩冒……”清代王清任亦指出年老而记性较差者,其脑髓逐渐空虚。《金匮要略·中风历节病脉证并治》:“……邪入于腑,即不识人。”赵冰等[6]总结“谢海州治疗老年性痴呆症经验”时指出,血管性痴呆症的病因、病机比较复杂,由于年老体弱,饮食失节,情志失调,历经艰辛,劳逸不当,导致脏腑功能衰退,气血不足,尤其是肾经亏损,髓海失养,脑髓失充,神明失司,代谢失调,而致风、火、痰、瘀蒙蔽心窍,上犯与脑,清窍失灵,神明失用,故其病在脑,其本在肾。《任继学经验集》中关于血管性痴呆这样说:临证当抓住虚实纲领,以“大实有羸状,至虚有盛候”为辨证要点。认为实者,以痰、瘀、毒、涎为主,而虚者则以精、髓、神、气为要。

我们课题组前期在取得了艾灸治疗VD丰富的临床经验和实验研究成果的基础上[7-12],发现以头部穴位组合为主的艾条压灸治疗VD具有“化瘀通络”之功效,我们临床运用化瘀通络灸法治疗VD取得了很好的疗效,并在前期研究中发现针刺涌泉、中冲穴可显著改善VD大鼠的学习记忆成绩,缩短P300的潜伏期,升高波幅[13],为该实验的研究做了准备。

本实验采用四血管闭塞法建立VD模型,大鼠脑组织可产生明显的病理改变,皮层、丘脑、尾核、海马等记忆区严重受损使Papez环路中段,但死亡率低,无明显肢体运动障碍[14]。此外,本研究培养的血管内皮细胞呈单层贴壁生长,细胞形态单一,呈棱形或多角形,核椭圆居中,互不重叠。在低倍镜下呈鹅卵石样排列,易于与平滑肌细胞、纤维细胞区别;本研究中划痕标记法,成本低、实验周期短、不需要特殊仪器设备,并且可以适用于各种培养细胞。体外培养人脐静脉内皮细胞株(HUVEC-12)是研究血管生成的一种直观有效方法。艾灸治疗VD在研究中[15]疗效已被验证[16-18],通过艾灸治疗后的动物血清干预HUVEC-12的体外培养研究,可以直观地分析艾灸后血清的效应物质对血管内皮细胞活化、增殖、迁移变化的影响[19]。

血管生成,即通过细胞增殖、出芽的方式形成新的血管网的过程[20],是建立侧支循环的一种主要方式,其过程包括内皮细胞的活化、增殖、迁移、中空的管腔形成以及已有的血管上萌发新血管等。细胞活化、增殖最重要的因子是血管内皮生长因子(VEGF),促血管内皮细胞迁移和管型形成最重要的因子是成纤维细胞生长因子(FGF)[21],本课题组在前期研究中,已经证实了化瘀通络灸法可以有效提高VD大鼠海马以及皮层 VEGF及其受体Flt-1、Flk-1MRNA,bFGF、BFGF-r的表达,对改善VD大鼠的症状有显著的效果。本实验通过艾灸治疗后动物血清干预HUVEC-12的体外培养研究,直观地分析艾灸后血清的效应物质对HUVEC-12活化、增殖、迁移、中空的管腔形成的影响,进一步说明血管生成对于治疗VD的积极作用。模型血清组大鼠自身诱导促新生血管的生长因子表达较模型血清组增多,但是结合其他指标,症状没有明显好转。又进一步表明了化瘀通络灸对促血管生成的优势所在。

老年期是经验丰富的阶段,一生中极为宝贵的时期,VD作为老年期痴呆第二位重要的疾病,正确的诊断和有效的治疗至关重要。研究化瘀通络灸法治疗VD的机理,从中得到预防和治疗的方法,具有重大的实际意义。

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The Effect of Stasis-eliminating and Meridian-unblocking Moxibustion on Vascular Endothelial Cell Proliferation and Migration in VD Rats

1,1,2,1.

1.230038,; 2.230038,

Objective To investigate the in vitro intervening effect of rat serum effector substances on vascular endothelial cell proliferation and migration after stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion and explore the possible proangiogenic mechanism of stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion treatment for vascular dementia. Method Male adult Wistar rats were used. A rat model of vascular dementia was made by four-vessel occlusion (4-VO). The rats were randomized to moxibustion, Western medication and model groups. A sham operation group was established as a control. There was a total of four groups. The moxibustion group received aconite cake moxibustion on point Baihui(GV20) and suspended moxibustion on points Dazhui(GV14) and Shenting(GV24) and the Western medication, an oral gavage of aniracetam tablets. Treatment was given 15 days as one course for a total of two courses. Blood was taken from the Orbital cavity in the moxibustion, sham operation and model groups after each course of treatment. After stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion, animal serum was prepared to intervene in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC-12) culture. Another parallel liquid group was set up. RPMI-1640 culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) was prepared. Endothelial cell proliferation was examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay. Endothelial cell migration was examined by cell scratch labeling. Result After two courses of treatment, the examination of endothelial cell proliferation by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay showed that rat serum intervened significantly in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC-12) proliferation in the moxibustion serum group compared with the model serum, sham operation serum and parallel liquid groups (＜0.01). At 24 hrs after two courses of treatment, the examination of endothelial cell migration by cell scratch labeling showed that rat serum intervention significantly increased the HUVEC-12 migration rate in the moxibustion serum group compared with the model serum, sham operation serum and parallel liquid groups (＜0.01). Conclusion Stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion has a marked improving effect on vascular endothelial cell proliferation and migration in vascular dementia rats, which provides strong evidence for its in vitro proangiogenic effect.

Dementia, vascular; Endothelial cell; Cell proliferation; Cell migration; Angiogenesis; Rats; Medicinal cake-partitioned moxibustion; Moxa stick moxibustion; Acupuncture-moxibustion serum

1005-0957(2017)04-0467-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.04.0467

2016-08-20

国家自然科学基金项目(81473785)

张曼(1988—),2014级硕士生,Email:84198813@qq.com

杨骏(1958—),男,教授,研究方向为针灸的临床作用机理研究,Email:yangjunacup@126.com