膀胱尿路上皮癌组织Livin和BCL-2的表达及其相关性研究

杨立军 郑文武 周安传 苏晓哲 吴亚东 李珅

·论著·

膀胱尿路上皮癌组织Livin和BCL-2的表达及其相关性研究

杨立军 郑文武 周安传 苏晓哲 吴亚东 李珅

目的 探讨Livin与BCL-2在膀胱尿路上皮癌及癌旁组织中的蛋白表达水平及二者在膀胱尿路上皮癌中的相关关系，分析其致癌机制，为膀胱尿路上皮癌的诊断及临床治疗提供理论依据。方法 用流式细胞分析技术检测90例膀胱尿路上皮癌及对应的90例癌旁组织，及20例正常膀胱粘膜移行上皮组织中的Livin、BCL-2蛋白的表达。90例膀胱尿路上皮癌中,男66例,女24例,年龄26～68(平均50.24±9.87)岁。按照WHO病理分级：G124例，G240例，G326例;TNM临床分期诊断标准：非浸润性癌(Ta-1期)38例，浸润性癌(T2-4期)52例;单发48例，多发42例；初发54例，复发36例；20例正常对照为前列腺增生症、膀胱结石患者经膀胱手术所取膀胱黏膜组织，均经病理检查证实为正常膀胱黏膜组织。将表达结果进行分析。结果 Livin在正常膀胱组织中不表达。于癌旁组织中亦无表达。Livin在膀胱尿路上皮癌组织中阳性率为71.11%，其中阳性64例，阴性26例。Livin的蛋白表达与细胞的凋亡率呈负相关。BCL-2阳性表达结果 膀胱癌癌组织(51.11%)与癌旁组织(73.33)BCL-2的表达差异有显著性 (P<0.05)。90例膀胱尿路上皮癌中46例BCL-2蛋白表达阳性，阳性率为51.11%，与正常膀胱粘膜阳性表达率10%比较，阳性率明显上升(P<0.05)。Bcl-2的蛋白表达与细胞的凋亡率呈负相关。在膀胱尿路上皮癌中Livin与BCL-2表达有密切关系 ,在膀胱癌BCL-2的表达随着膀胱肿瘤的分化程度越差阳性表达就增加 ,而Livin蛋白的表达亦明显增加 ,呈现正相关 (P<0.05)。结论 细胞凋亡抑制因子Livin在膀胱尿路上皮癌组织中表达上调，并且与凋亡率呈负相关，提示Livin可能通过抑制细胞凋亡，对膀胱尿路上皮癌的发生、发展起重要作用，有望成为一种有效、敏感的肿肿瘤标志物志物，并为膀胱尿路上皮癌的基因治疗提供新的靶点。Livin与BCL-2在膀胱尿路上皮癌细胞凋亡的调控方面可能起着协同作用。

Livin：BCL-2:膀胱尿路上皮癌：癌旁：蛋白表达：流式细胞分析技术

膀胱癌正式名称为膀胱尿路上皮细胞癌(TCC)，是泌尿生殖 系肿瘤中最常见的肿瘤，近年发病有增加趋势。男性发病率约为女性的3～4倍，发病年龄以51～70岁为多，临床最常见的首发症状是血尿，而且表现为间隙性、无痛性血尿为主。目前研究表明，肿瘤发生是细胞增殖因子与细胞凋亡因子失衡所致，受多种因素控制。凋亡抑制蛋白(IAP)是一类内源性抑制因子，其高表达引起凋亡不足，与肿瘤发生关系密切。Livin是一种新近发现的IAP成员,其作用机制主要通过直接抑制procaspase或caspase来抑制细胞凋亡。BCL-2通过对线粒体、内质网、死亡受体通路的调控，来抑制细胞凋亡。本文用流式细胞分析技术研究Livin与BCL-2在膀胱尿路上皮癌、癌旁组织中的蛋白表达水平及二者在膀胱尿路上皮癌中的相关关系，为膀胱尿路上皮癌的诊断及临床治疗提供理论方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 标本取自2012至2013年我院泌尿外科手术治疗的住院患者，检测90例膀胱尿路上皮癌及对应的90例癌旁组织，20例正常膀胱粘膜组织中的Livin、Bcl-2蛋白的表达水平。90例膀胱尿路上皮癌患者中，术后均经病理证实为膀胱尿路上皮癌，其中男66例,女24例；年龄26～68岁，平均(50.24±9.87)岁。按照WHO病理分级：G124例，G240例，G326例;TNM临床分期诊断标准：非浸润性癌(Ta-1期)38例，浸润性癌(T2-4期)52例;单发48例，多发42例；初发58例，复发32例；20例正常对照为经膀胱手术所取的前列腺增生症、膀胱结石的膀胱黏膜组织，均经病理证实为正常膀胱黏膜组织。标本经4%多聚甲醛固定。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂：鼠抗人Livin单克隆抗体(工作浓度1∶700)，美国NEOMARKERS公司；兔抗人Bcl-2多克隆抗体，SantaCruz公司；hanks(缓冲液)，百浩生物科技有限公司；AlexaFiuor488(异硫氰酸荧光素)，Proteintech公司；胃蛋白酶工作液，上海易欣生物科技有限公司。

1.2.2 仪器:BDFACSEALIBUR流式细胞仪BDBioscience公司(U.S.A)。

1.3 试验方法 应用流式细胞分析技术检测。

1.4 试验步骤 在检测蛋白免疫荧光标记物时，设hanks(缓冲液)为阴性对照，二抗AlexaFiuor488(异硫氰酸荧光素)为阳性对照。具体操作步骤如下：

1.4.1 标本蜡块的处理：在切片机上将蜡块包埋的组织切取3～5片40～50μm厚的组织片。

1.4.2 脱蜡：将切取的组织片用二甲苯5～8ml(室温)浸泡2～3d，脱净石蜡。

1.4.3 水化：依次用100%、95%、70%、50%浓度的乙醇6～8ml对组织进行水化，每次水化10～15min，弃掉乙醇后加入0.9%氯化钠溶液5～8ml浸泡30min后弃掉0.9%氯化钠溶液。

1.4.4 消化：经水化的组织加入0.5%胃蛋白酶(pH值1.5～2)2ml，置37℃恒温水浴中，每10分钟振荡1次。至30min，立即加入0.9%氯化钠溶液终止消化。

1.4.5 过滤：将消化好的组织放在120目不锈钢网上，下置一平皿，将组织剪碎并轻轻搓组织，边搓边用生理盐水冲洗，直至将组织搓完。将平皿中的混悬液用300目铜网过滤去掉细胞团块。

1.4.6 离心：将收集的细胞悬液依次离心沉淀1 500r/min、1 000r/min，4min，均去掉多余悬清液，以0.9%氯化钠溶液漂洗1次，再离心沉淀800r/min，4min，去掉多余悬清液，剩约0.5ml。

1.4.7 标抗：将Livin和Bcl-2一抗均按1∶50进行稀释。离心后的组织分二等份，分别加入Livin和Bcl-2抗体工作液0.1ml，静置1h，加入hanks(0.01mol/L)5～8ml，离心沉淀800r/min，4min，弃悬清液，每个试管内再加入二抗(AlexaFiuor488)100μl，2h后，加入hanks5～8ml，离心同上，除去未结合的荧光二抗，上机检测。

1.5 结果评定标准Livin和Bcl-2蛋白表达含量以细胞的平均荧光强度表示，为了使免疫荧光定量分析更加完备，将平均荧光强度换算成荧光指数(FI)，用FI来表示Livin和Bcl-2在组织中的相对表达含量，按照组织细胞表达荧光指数大小对其进行统计分类，FI≤1判定表达量为阴性，FI>1判定为阳性。应用流式细胞仪检测Livin,Bcl-2阳性和阴性表达细胞的凋亡率。

2 结果

2.1 Livin蛋白在膀胱组织中的表达特征 Livin在正常膀胱组织及癌旁组织中不表达。Livin在膀胱尿路上皮癌组织中阳性表达率为71.11%。Livin在膀胱尿路上皮癌组织中表达上调。见表1。

表1 Livin蛋白在膀胱组织中的表达 例

注: 与TCC比较，*P<0.05

2.2Bcl-2蛋白在膀胱组织中的表达特征Bcl-2在癌旁组织与膀胱癌组织的阳性表达率分别为73.33%和51.11%，膀胱癌组织与癌旁组织Bcl-2的表达差异显著 (P<0.05)。45例膀胱尿路上皮癌中Bcl-2蛋白阳性率为51.11%(46/90)，与正常膀胱黏膜阳性表达率10%相比较，阳性率明显上升(P<0.05)。癌旁组织Bcl-2的阳性表达率与正常膀胱黏膜阳性表达率差异有统计学意义 (P<0.05)。见表2。

表2 Bcl-2蛋白在膀胱组织中的表达 例

注: 与正常膀胱比较，*P<0.05；与TCC比较，#P<0.05

2.3Livin蛋白与Bcl-2蛋白表达与凋亡率的关系 膀胱尿路上皮癌组织中Livin蛋白表达阳性的凋亡率明显低于阴性表达。同样，Bcl-2蛋白表达阳性的凋亡率明显低于阴性表达。均呈负相关。见表3、4。

组别凋亡率t值P值阳性(n=64)4.23±0.6816.8030.000阴性(n=26)8.79±1.10

组别凋亡率t值P值阳性(n=46)4.29±0.6716.3410.000阴性(n=44)8.85±1.15

2.4 膀胱尿路上皮癌组织中Livin蛋白与Bcl-2蛋白表达的相关性Bcl-2在膀胱尿路上皮癌组织中阳性表达中的Livin阳性表达率为91.30%，Bcl-2在膀胱尿路上皮癌组织中阴性表达中的Livin阳性表达率为50.00%，两者表达呈正相关(P<0.01)。见表5。

表5 膀胱尿路上皮癌组织中Livin蛋白与 Bcl-2蛋白表达的相关性 例(%)

3 讨论

Livin(又称KIAP.MLIAP)是新发现的一个IAP家族成员，Ashhab等[1]明确了Livin基因位于人染色体20q13.3,全长4.6kb,包含7个外显子。基因转录产物mRNA长1.4kb。Livin蛋白N端仅包含一个BIR结构,C端含一个RING环指结构。编码的Livin蛋白Livinα和Livinβ分别由298和280个氨基酸组成，Livin氨基酸残基C124,C127,H44及C151与锌原子结合，以稳定整个重叠结构。Livinα和Livinβ蛋白分子量分别为39 000和37 000。Kasof等[2]认为Livin同时成丝状表达于胞质和胞核。其抗细胞凋亡机制为:(1)抑制Caspase途径:Livin可与介导细胞凋亡的下游效应Caspase,即激活形式的Caspase-3和Caspase-7结合,并抑制其活性。Livin还可与未加工的或断裂形式的Caspase-9结合,可抑制由Apaf-1(apoptosisprotein-activatingfactor-1),细胞色素C及dATP诱导的Caspase-9激活作用。Livin与Caspase的结合抑制作用具有高度的特异性和亲和性,这有赖于其BIR结构域的完整,BIR结构域内单个氨基酸的突变即可导致Livin与Caspase的结合作用及Livin抗细胞凋亡作用的明显降低甚至完全丧失。抑制Caspase途径:Livin可与介导细胞凋亡的下游效应Caspase,即激活形式的Caspase3和Caspase7结合,抑制其活性，从而阻断各种刺激因素诱导的细胞凋亡过程。(2)激活TAK1/JNK1信号传导途径:Livin可激活MAP(mitogenactivatedprotein)激酶JNK1和JNK2,从而抑制细胞凋亡。TAK1是一上游MAP3激酶,在TGFβ1的刺激下可激活JNK1。TAB1是TAK1的共反应子(coactivator),TAB1本身对于JNK1无激活作用,但可促进TAK1介导的JNK1激活作用。而抑制细胞凋亡。鉴于Livin具有明显的抗凋亡作用,人们开始日益关注其与肿瘤发生及发展的关系。

本研究显示Livin在膀胱尿路上皮癌中阳性表达率为71.11%,而在正常膀胱黏膜组织及癌旁组织中无表达。细胞凋亡抑制因子Livin在膀胱尿路上皮癌组织中表达增加，提示Livin可能通过抑制细胞凋亡，对膀胱尿路上皮癌的发生、发展起重要作用，Livin在膀胱癌中的高表达有望成为一种有效、敏感的瘤标，并为膀胱尿路上皮癌的基因治疗提供新的方向。本研究结果也说明Livin表达阳性的凋亡率明显低于阴性表达，即Livin表达与凋亡率呈负相关，表明Livin参与膀胱尿路上皮癌的凋亡调控。Gazzaniga等[3]结果显示Livinα和Livinβ在正常膀胱组织中均无表达,Livinβ在膀胱癌组织中也无表达,而Livinα表达阳性率为23%。进一步分析显示Livinα表达阳性的患者术后肿瘤平均复发时间为3.5个月,而Livinα表达阴性的患者则延长至27.2个月,差异明显(P<0.01),提示Livinα表达与膀胱癌患者治疗预后关系密切。有文献报道以Livin基因为靶点的RNAi技术可以有效的特异性阻断内源性Livin基因的表达，使得caspase-3活化，明显增强各种促凋亡因素(如阿霉素、紫外线照射、TNF-α)导致的细胞凋亡率[4]。用Livin基因的反义核酸和Smac肽反向调节Livin基因的抗凋亡活性也收到明显的效果，包括增加化疗药物的促凋亡作用[5]。

Bcl-2是凋亡研究中热点癌基因之一。Bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白，位于线粒体内膜、内质网和核膜，分子量为26 000。研究表明Bcl-2与恶性肿瘤的恶性程度的强弱明显相关[6]。其中抑制凋亡的Bcl-2 与促进凋亡的Bax互相拮抗。Bcl-2 蛋白是一个良好的预后指标[7]。其抑制细胞凋亡的主要机制为:阻止细胞色素C从线粒体释放，抑制caspase蛋白酶的活化[8]; 抑制内质网内Ca2+进入细胞，线粒体基质中高浓度的Ca2+促进反向转运载体(anfiporter)-ANT与亲环素D(CypD)结合，抑制PT孔的开放[9]。Bax蛋白存在于细胞内膜、细胞质和细胞核上，含有BH1-BH3 三个Bcl-2 家族特征性结构域及疏水C末端的跨膜结构域。其生物学作用主要是形成Bax同源二聚体时拮抗Bcl-2 促进细胞凋亡。实验研究表明，Bax和Bcl-2 形成同源或异源二聚体后根据Bcl-2/Bax的比例调控细胞的凋亡，Bax蛋白高表达时加速细胞凋亡，Bcl-2 蛋白高表达时抑制细胞凋亡[10]。本试验Bcl-2在正常膀胱粘膜中低表达,在膀胱尿路上皮癌及癌旁细胞中高表达。本研究结果也显示Bcl-2表达阳性的凋亡率明显低于阴性表达，即Bcl-2表达与凋亡率呈负相关，表明Bcl-2参与膀胱尿路上皮癌的凋亡机制。本实验研究了Livin与Bcl-2的表达的相关性，在膀移行细胞癌中Livin与Bcl-2表达有密切关系,在膀胱癌Bcl-2的表达随着膀胱肿瘤的分化程度越差阳性表达就增加,而Livin蛋白的表达亦明显增加,呈现正相关(P<0.05)。已有的相关检验表明Livin与Bcl-2表达密切相关(P<0.05)，Livin与Bcl-2在膀胱尿路上皮癌细胞凋亡的凋控方面起着协同作用。推测其机制可能是共同抑制Caspase途径从而抑制细胞的凋亡，促进肿瘤的发生、发展。但相关课题研究较少，尚需进一步探究。

1AshhabY,AlianA,PolliackA,etal.Twosplicingvariantsofanewinhibitorofapoptosisgenewithdifferentbiologicalpropertiesandtissuedistributionpattern.FEBSLett,2001,495:56-60.

2KasofGM,GomesBC.Livin,anovelinbitorofapoptosisproteinfamilymember.JBiolChem,2001,276:3238-3246.

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.031

050051 河北省石家庄市第一医院泌尿外科

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1002-7386(2017)08-1228-04

2016-12-09)