卡维地洛治疗对病毒性心肌炎小鼠心肌组织中细胞因子影响的分析

张渝，阳倩

· 论著 ·

卡维地洛治疗对病毒性心肌炎小鼠心肌组织中细胞因子影响的分析

张渝1，阳倩1

目的 探讨卡维地洛治疗对病毒性心肌炎小鼠心肌组织中细胞因子的影响。方法 雄性4周龄BALB/c小鼠75只，随机分为对照组、心肌炎组、心肌炎+卡维地洛治疗组，每组各25只。将存活小鼠取血后处死并留取心脏标本。光镜观察各组小鼠心肌组织病理改变情况，采用高效液相色谱－电化学法检测血浆去甲肾上腺素含量，荧光定量实验检查心肌组织中白介素-6（IL-6）mRNA表达，Western blot检测心肌组织中IL-6蛋白表达水平。结果 在治疗后的第7 d与第14 d，心肌炎组小鼠的心脏重量（HW）/身体重量（BW）比值、血浆去甲肾上腺素浓度明显高于对照组，有明显统计学差异（P＜0.05），卡维地洛组小鼠的HW/BW比值、血浆去甲肾上腺素浓度明显低于心肌炎组，有明显统计学差异（P＜0.05）；对照组小鼠未见异常病理变化，而在治疗后的第7 d与第14 d，卡维地洛组小鼠的心肌炎症浸润、心肌细胞变性坏死较心肌炎组小鼠明显减轻，其组织评分也低于心肌炎组，有显著统计学差异（P＜0.05）；在治疗后的第7 d心肌炎组小鼠的心肌组织IL-6 mRNA和蛋白的表达明显高于对照组小鼠，有明显统计学差异（P＜0.05），卡维地洛组的小鼠的心肌组织IL-6 mRNA和蛋白的表达较心肌炎组明显降低，有明显统计学差异（P＜0.05），在治疗后的14 d，三组小鼠的心肌组织IL-6 mRNA和蛋白的表达无明显统计学差异（P＞0.05）。结论 卡维地洛可以抑制病毒性心肌炎小鼠IL-6的表达，保护心肌组织，具有较好的疗效。

病毒性心肌炎；卡维地洛；白介素-6；儿茶酚胺

病毒性心肌炎是一种因病毒感染造成的免疫损伤与心肌坏死，严重者可出现心力衰竭、扩张性心肌病，甚至是心源性猝死[1]。心肌出现损伤后，能够促使肾素-血管紧张素（RAS）与交感-肾上腺素能系统（SAS）活性增加，进而诱导心肌组织中细胞因子白介素-6（IL-6）的表达[2]。IL-6是心肌炎发病的代表性促炎细胞因子，能够造成心肌受损，诱导心律失常，导致心肌重构。有报道称[3]，儿茶酚胺作为一种交感神经递质，广泛的参与IL-6的调控，在病毒性心肌炎的发生发展中扮演极其重要的角色。卡维地洛是第 3代β受体阻滞剂，不仅可阻断儿茶酚胺从而抑制炎症反应，还可以调控细胞因子水平。因此，本研究观察卡维地洛治疗对病毒性心肌炎小鼠的儿茶酚胺及细胞因子IL-6 水平的影响，以此为临床诊疗提供建议。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 雄性BALB/c小鼠75只（由上海实验动物中心提供），4周年龄，体重150～200 g。小鼠分笼饲养，正常光照，自由饮水和摄食，温度22℃，相对湿度50%～70%。

柯萨奇病毒（Coxsackievirus B3，CVB3）Nancy株（由美国ATCC公司提供）经Hep2细胞（来自上海生化细胞所）活化增殖，于细胞的病变效应（CPE）》75%（++—+++）时收获，且滴度控制为107TCID 50/0.1 mL。按简单完全随机分组法将小鼠随机分为对照组、心肌炎组、卡维地洛组，每组25只。其中，心肌炎组与卡维地洛组小鼠于腹腔注射0.1 mL浓度为100 TCID50/0.1 mL的柯萨奇病毒稀释液，对照组于腹腔注射等量的0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS）。卡维地洛组于病毒接种后的第1 d行灌服卡维地洛，剂量为10 mg·kg-1·d-1，14 d为一个疗程，对照组与心肌炎组于同一时间采用同法灌服等量0.1 mmol/L PBS。

1.2 主要试剂 卡维地洛片（12.5mg，宁波天衡药业股份有限公司）；IL-6Mrna检测试剂盒（Epitomics公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔IL-6抗体及相关染色试剂（重庆威斯腾生物医药科技有限公司）；去甲肾上腺素（NE）标准品（江苏兰健药业有限公司）。

1.3 标本留取 各组小鼠于治疗第7 d时，随机从各组选取10只小鼠，取血后经断颈处死，用眼科剪将小鼠心脏沿左室中线切为两半，1/2心脏组织行细胞因子的测定，余下的1/2心脏组织固定于4%多聚甲醛溶液，行病理组织学检查。于一个疗程结束时，随机选取各组余下小鼠中剩余的10只并处死，方法与目的同第7 d。

1.4 小鼠心脏重量（HW）/身体重量（BW）比值的测定 分别于治疗第7 d及一个疗程结束时测定小鼠HW及BW，并计算HW/BW。

1.5 心肌组织病理学检查 将固定于4%甲醛溶液中的心脏组织，常规脱水，再用10%EDTA脱钙。进行石蜡包埋、常规切片，控制厚度为5μm，HE染色后于光镜下查看心肌的病理改变。判断标准为：出现炎症细胞浸润，每张心脏切片中心肌坏死＜25%（+）作为1分，25%～50%（++）作为2分，51%～75%（+++）作为3分，＞75%作为4分[4]。

1.6 小鼠血浆去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）水平检测 采用高效液相色谱－电化学法检测[5]，准备Zorbax CB-Aq反相色谱柱（150 mm ×3 mm，3.5μm），制备对照品溶液后，添加0.1mol/L的高氯酸于血浆样本中，并采取置冷冻离心机（＜4℃）以18 000 r/min，分离15 min，留取上清液后继续以18 000 r/min，分离15 min，留取上清液，用0.22 μm的滤膜进行过滤，绘制标准曲线后计算NE含量。

1.7 心肌组织IL-6 mRNA的表达 Trizol法提取心肌总RNA并测定其浓度及纯度。根据IL-6 mRNA序列设计荧光定量PCR引物：上游5’-CAAGAC CATTGCACGAGAGG-3’，下游5’-CCCGAAG GCAGAAGTGAAG-3’，退火温度59℃，共40个循环。内参IL-6荧光定量PCR引物序列：上游5’TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游5’-CTA AGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’，退火温度为59℃，共40个循环。取同一样本总RNA 1μL进行RT-PCR反应。

1.8 Western blot测定小鼠心肌组织中IL-6蛋白的含量 取小鼠心肌组织至离心管，加500μl裂解液，5μl蛋白磷酸酶抑制剂混合物，剪碎组织，高速机械匀浆器破碎组织。将组织匀浆1.5 ml转移至离心管，加3 ml抽提试剂及5 μl蛋白磷酸酶抑制剂混合物混匀，3℃静置15 min。10 000r/min离心8 min，取上下液体中间的蛋白膜，加入2% SDS水溶液，90℃煮15 min。用IL-6蛋白检测试剂盒在多功能酶标仪上检测蛋白浓度，结果采用EXCEL 软件制图。

1.9 统计学方法 所有数据均采用SPSS 15.0统计学软件分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间均数的比较采用t检验，计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组小鼠HW/BW比值的对比 在治疗后的第7 d与第14 d，心肌炎组小鼠的HW/BW比值明显高于对照组，有明显统计学差异（P＜0.05）；卡维地洛组小鼠的HW/BW比值明显低于心肌炎组，有明显统计学差异（P＜0.05）（表1）。

2.2 心肌的病理组织学改变 对照组小鼠未见异常病理变化（图1），而在治疗后的第7 d与第14 d，卡维地洛组小鼠的心肌炎症浸润、心肌细胞变性坏死较心肌炎组小鼠明显减轻，其组织评分也低于心肌炎组，有明显统计学差异（P＜0.05）（表1）。

2.3 血浆NE浓度 在治疗后的第7 d和第14 d心肌炎组小鼠的血浆NE浓度明显高于对照组小鼠，有明显统计学差异（P＜0.05），卡维地洛组小鼠的血浆NE浓度较心肌炎组明显降低，有明显统计学差异（P＜0.05）（图2）。

表1 各组小鼠HW/BW比值与心肌病理组织学评分比较（±s）

表1 各组小鼠HW/BW比值与心肌病理组织学评分比较（±s）

注：HW：心脏重量；BW：身体重量；与对照组比较，aP＜0.05；与心肌炎组比较，bP＜0.05

项目 对照组（n=10） 心肌炎组（n=10） 卡维地洛组（n=10）HW/BW比值（10-3） 4.24±0.21 4.31±0.23 6.54±0.47a6.79±0.51a5.36±0.37ab5.41±0.28ab炎症 - - 2.63±0.34 1.82±0.27 1.14±0.21b0.84±0.17b坏死 - - 1.92±0.21 2.66±0.23 1.14±0.14b1.4±0.21b

图1 各组小鼠心肌病理组织学变化（HE，×200）A：对照组；B：心肌炎组（第7 d）；C：卡维地洛组（第7 d）；D：心肌炎组（第14 d）；E：卡维地洛组（第14 d）

2.4 心肌组织IL-6 mRNA的表达 在治疗后的第7 d心肌炎组小鼠的心肌组织IL-6 mRNA的表达明显高于对照组小鼠，有明显统计学差异（P＜0.05），卡维地洛组的小鼠的心肌组织IL-6 mRNA的表达较心肌炎组明显降低，有明显统计学差异（P＜0.05）。在治疗后的14 d，三组小鼠的心肌组织IL-6 mRNA的表达无明显统计学差异（P＞0.05）（图3）。

2.5 心肌组织IL-6蛋白表达水平 在治疗后的第7 d心肌炎组小鼠的心肌组织IL-6蛋白的表达明显高于对照组小鼠，有明显统计学差异（P＜0.05），卡维地洛组的小鼠的心肌组织IL-6蛋白的表达较心肌炎组明显降低，有明显统计学差异（P＜0.05）。在治疗后的14 d，三组小鼠的心肌组织IL-6蛋白的表达无明显统计学差异（P＞0.05）（图4）。

图2 三组小鼠血浆去甲肾上腺素浓度的对比（±s，n=10）注：与对照组比较，aP＜0.05；与心肌炎组比较，bP＜0.05

图3 三组小鼠心肌组织IL-6mRNA表达的对比（±s，n=10）注：与对照组比较，aP＜0.05；与心肌炎组比较，bP＜0.05

图4 三组小鼠心肌组织IL-6蛋白表达水平的对比（±s，n=10）注：与对照组比较，aP＜0.05；与心肌炎组比较，bP＜0.05

3 讨论

有较多的细胞因子参与病毒性心肌炎的病情发展中，其中较为典型的是IL-6。另外，有报道称[6]，在患者体内发现儿茶酚胺含量较高，其对心肌组织具有一定的毒性作用。目前尚无针对治疗病毒性心肌炎的特效药，临床上多以保守药物治疗为主。β受体阻滞剂是慢性心衰的首选药物，因其可抑制慢性心衰患者体内的儿茶酚胺含量，从而降低心肌的毒性[7]。卡维地洛属于第3代β受体阻滞剂，其广泛应用于高血压及心衰患者的治疗中，具有广泛的生物学效应，如抗氧化、抗增殖、抑制心肌细胞凋亡等作用，卡维地洛主要通过降低线粒体内钙超载，从而抑制过氧化氢的表达，抑制细胞凋亡[8]。但有关卡维地洛在治疗病毒性心肌炎中的应用尚不多见，本研究通过腹腔接种CVB3制成病毒性心肌炎小鼠模型，来观察卡维地洛在病毒性心肌炎小鼠中的应用。

在本研究中，卡维地洛组的小鼠的HW/BW比值、心肌炎症坏死以及小鼠存活率都明显优于心肌炎组小鼠（P＜0.05）。这都说明卡维地洛可以有效的保护病毒性心肌炎小鼠的心肌组织，减少心肌受损，提高存活率。这与吴蓉洲的研究结果是一致的[9]。在对各组小鼠的血浆NE含量对比发现，在治疗后的第7 d及第14 d，心肌炎组的血浆NE含量明显高于对照组小鼠（P＜0.05），说明经CVB3感染后的小鼠其体内儿茶酚胺含量明显升高。有研究表明[10]，给心肌炎小鼠体内注射NE不仅可以加重心肌损伤，还可以增加促炎细胞因子的含量。在治疗后的第7 d及第14 d卡维地洛组小鼠的血浆NE含量较心肌炎组明显降低（P＜0.05），说明卡维地洛可以降低儿茶酚胺的含量，从而抑制儿茶酚胺的毒性作用。儿茶酚胺可刺激β肾上腺能受体，介导T细胞功能，从而调控炎症细胞因子。IL-6就是较为典型的受儿茶酚胺调控的细胞因子。而IL-6的表达可以促进病毒性心肌炎患者病情的发展，有研究表明，通过基因敲除来抑制IL-6的表达，可以明显改善心肌组织的损伤。在本研究中，我们对各组小鼠的心肌组织IL-6 mRNA及IL-6蛋白表达水平进行对比发现，在治疗后的第7 d，卡维地洛组小鼠的心肌组织IL-6 mRNA及IL-6蛋白表达水平均明显低于心肌炎组小鼠（P＜0.05）。说明卡维地洛可以通过抑制儿茶酚胺的毒性作用来降低心肌组织IL-6 mRNA及IL-6蛋白的表达，避免心肌组织进一步受损，提高存活率。

综上所述，卡维地洛可以抑制儿茶酚胺的毒性作用，降低IL-6表达水平，保护心肌组织不受损伤，提高存活率，但其机制需进一步研究。

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本文编辑：杨新颖，姚雪莉

Effect of carvedilol on cytokines in myocardial tissue of mice with viral myocarditis

ZHANG Yu*, YANGQian.*Department of pediatrics, Sichuan Provincial People's Hospital, Chengdu 610072, China.

YANG Qian, E-mail: 2500743036@qq.com

Objective To investigate the effect of carvedilol on cytokines in myocardium of mice with viral myocarditis. Methods 4-week-old BALB / c male mice were randomly divided into control group, myocarditis group and myocarditis + carvedilol treatment group, 25 rats in each group. The surviving mice were sacrificed and the heart specimens were taken. The pathological changes of myocardium were observed by light microscope. The plasma norepinephrine content was measured by high performance liquid chromatography-electrochemical method. Fluorescence quantitative test was used to examine the expression of interleukin-6 (IL-6) mRNA in myocardium. Western blot was used to detect the expression of IL-6 protein in myocardium. Results The levels of HW / BW and plasma norepinephrine in the myocarditis group were significantly higher than those in the control group at the 7th and 14th day after treatment (P＜0.05). The ratio of HW / BW and plasma norepinephrine in carvedilol group were significantly lower than those in myocarditis group (P＜0.05). There were no abnormal pathological changes in the control group. On the 7th and 14th day after treatment, the myocardium infiltration and myocardial degeneration and necrosis of the carvedilol group were significantly less than those in the myocarditis group, and the tissue score was lower than that in the myocarditis group (P＜0.05). The expression of IL-6 mRNA and protein in the myocardium of the myocarditis group was significantly higher than that of the control group (P＜0.05). The expression of IL-6 mRNA and protein in myocardial tissue of carvedilol group was significantly lower than that in myocarditis group (P＜0.05). There was no significant difference in the expression of IL-6 mRNA and protein in the myocardium of the three groups (P＞0.05) at 14 days after treatment. Conclusion Carvedilol can inhibit the expression of IL-6 in mice with viral myocarditis and protect the myocardium, which has a good effect.

Viral myocarditis; Carvedilol; Interleukin-6; Catecholamine

R542.21

A

1674-4055(2017)03-0317-04

1610072 成都,四川省人民医院儿科

阳倩,E-mail:2500743036@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.03.17