功能磁共振和ApoE及MTHFR基因在皮质下缺血性小血管病患者早期认知障碍中的相关性研究

邹小冬+张震中+程有根+李中春+王海+胡智伟

[摘要] 目的 分析功能磁共振和ApoE、MTHFR基因在皮質下缺血性小血管病（subcortical ischemic small vessel disease，SSVD）患者早期认知障碍中的相关性，为临床诊断提供参考依据。方法 收集我院收治的120例SSVD患者，根据有无认知功能损害分为认知正常组（normal cognitive-SSVD group，NC-SSVD，n=52）和非痴呆认知障碍组（vascular cognitive impairment no dementia-SSVD group，VCIND-SSVD，n=68），均行磁共振血流量扫描（magnetic resonance spectroscopy，MRS）和弥散张量成像（diffusion tensor imaging，DTI）检查，并行蒙特利尔认知评估量表（montreal cognitive assessment，MoCA）调查，通过PCR扩增-限制性片段长度多态性法（PCR-RFLP）测定ApoE及MTHFR基因多态性，分析MRS、DTI参数与MoCA评分的相关性。结果 VCIND-SSVD组回忆力、注意力与计算力、延迟回忆、视空间与执行功能力及MoCA总分均明显低于NC-SSVD组（P<0.05）；VCIND-SSVD组胼胝体压部及双侧海马、额叶FA值低于NC-SSVD组，胼胝体压部及双侧海马MD值明显高于NC-SSVD组（P<0.05）；VCIND-SSVD组ε3/4+ε4/4、TT基因型和ε4、T等位基因的频率均明显高于NC-SSVD组（P<0.05）；VCIND-SSVD组右侧额叶NAA/Cr值明显低于NC-SSVD组，左侧颞叶mI/Cr值明显高于NC-SSVD组（P<0.05）；双侧海马、额叶及胼胝体压部FA值、胼胝体压部及双侧海马MD值、右侧额叶NAA/Cr值、左侧颞叶mI/Cr值与MoCA评分呈显著相关性（P<0.05）。结论 MRS、DTI及ApoE、MTHFR基因多态性与SSVD患者早期认知障碍有密切关系，在SSVD患者认知障碍诊断及评估中具有一定的临床价值。

[关键词] 认知功能障碍；皮质下缺血性小血管病；功能磁共振；ApoE；MTHFR基因多态性；相关性

[中图分类号] R749.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）07-0019-05

[Abstract] Objective To investigate the correlation between functional magnetic resonance （MR） and ApoE and MTHFR genes in early cognitive impairment in the patients with subcortical ischemic small vessel disease（SSVD）， and to provide reference for clinical diagnosis. Methods A total of 120 patients with SSVD were collected and divided into the normal cognitive-SSVD group（NC-SSVD， n=52） and vascular cognitive impairment no dementia-SSVD group （VCIND-SSVD， n=68） according to whether there was cognitive impairment or not. Magnetic resonance spectroscopy（MRS） and diffusion tensor imaging（DTI） were performed in all patients. At the same time， Montreal cognitive assessment （MoCA） was performed. Polymorphisms of ApoE and MTHFR genes were determined by PCR-RFLP. The correlation between MRS， DTI parameters and MoCA score was analyzed. Results The ability of recall， attention and calculation， delayed recall， visual space and executive function and the total score of MoCA in VCIND-SSVD group were significantly lower than those in NC-SSVD group（P<0.05）； the FA values of splenium of corpus callosum and bilateral hippocampus and frontal lobe in VCIND-SSVD group were lower than those in NC-SSVD group. The MD value of splenium of corpus callosum and bilateral hippocampus were significantly higher than those in the NC-SSVD group （P<0.05）； the frequencies of ε3/4+ε4/4， TT genotype and ε4， T alleles in VCIND-SSVD group were significantly higher than those in NC-SSVD group（P<0.05）； the NAA/Cr value of the right frontal lobe in VCIND-SSVD group was significantly lower than that in NC-SSVD group， and the value of mI/Cr in the left temporal lobe was significantly higher than that in the NC-SSVD group（P<0.05）； there were significant correlations between the FA values of bilateral hippocampus， frontal lobe and splenium of corpus callosum， the MD values of splenium of corpus callosum and bilateral hippocampal， NAA/Cr value of the right frontal lobe， mI/Cr value of the left temporal lobe and MoCA scores（P<0.05）. Conclusion MRS， DTI and ApoE， MTHFR gene polymorphisms are closely related to early cognitive impairment in SSVD patients， which plays a certain clinical value in the patients with SSVD in the diagnosis and assessment of cognitive impairment.

[Key words] Cognitive impairment； Subcortical ischemic small vessel disease （SSVD）； Magnetic resonance （MR）； ApoE； Gene polymorphism； Correlation

近几年，随着我国人口老龄化的加速，血管性认知功能障碍（vascular cognitive impairment，VCI）患病率逐年上升，但VCI具有显著的异质性，临床中尚无统一标准，成为其研究的主要难点。有研究发现[1]，部分VCI为皮质下缺血性小血管病（SSVD）所致，SSVD为VCI发展的早期阶段，且具有较好的均质性。因此，对SSVD进行早期诊断和早期干预被认為是延缓认知损害发展、阻止其进展成为血管性痴呆的关键所在。功能磁共振在诊断SSVD所致认知功能障碍方面已显示了良好的应用前景，对机体白质纤维束损害有较高的敏感性。相关临床研究指出，基因多态性与认知功能存在相关性，其中ApoE基因是目前公认的迟发性阿尔茨海默病的易感基因，也被认为是血管性痴呆的危险因素[2]；亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是血浆同型半胱氨酸的限速酶，是VCI发病的重要危险因素[3]。基于此，本研究分析了功能磁共振和ApoE、MTHFR基因在SSVD患者早期认知障碍中的相关性，旨在为临床诊断提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年1月～2016年12月我院收治的120例SSVD患者，入选标准：（1）年龄45～65岁；（2）汉族，且均为右利手；（3）文化程度在小学及以上；（4）存在中重度脑白质病变（Fazekas量表≥3）伴多发腔隙性梗死（幕上≥2个，病灶直径2～15 mm），无皮质或分水岭部位梗死，无出血性脑血管病或脑微出血，无其他脑部病变如肿瘤、多发性硬化、脑积水等[4]；（5）小学学历患者简易智能状态量表（mini-mental state examination，MMSE）≥20分，初中及以上患者≥24分；（6）能够配合神经心理学检查；（7）距最近1次卒中发病至少3个月。排除标准：（1）汉密尔顿抑郁量表评分≥18分，汉密尔顿焦虑量表>21分；（2）严重心、肝、肾等脏器疾病或未经药物控制的精神疾病者；（3）非脑血管病原因导致的认知障碍者；（4）严重瘫痪者；（5）意识障碍或谵妄等影响认知检查者。根据SSVD患者有无认知功能障碍分为认知正常组（NC-SSVD，n=52）和非痴呆认知障碍组（VCIND-SSVD，n=68），其中非痴呆认知障碍组入选标准：参照Wentzel提出的VCI诊断标准[5]：（1）有脑血管病史或危险因素；（2）蒙特利尔量表MoCA<26分（受教育年限小于12年加1分），临床痴呆评定量表（CDR）=0.5；（3）排除非皮质下小血管病引起的认知功能损害；（4）未达到美国精神障碍诊断和统计手册第四版（DSM-IV）的痴呆诊断标准[6]。认知正常组入选标准：（1）符合SSVD纳入标准；（2）无认知障碍，MoCA≥26，CDR=0。NC-SSVD组男34例，女18例；年龄46～63岁，平均（55.71±3.62）岁；学历分布：小学及初中13例，高中及以上39例。VCIND-SSVD组男47例，女21例；年龄46～64岁，平均（55.89±3.24）岁；学历分布：小学及初中16例，高中及以上52例。两组受试者年龄、性别、学历分布比较差异无统计学意义（P>0.05）。两组患者均无MRI检查禁忌证，本研究经医院伦理委员会研究同意，并与患者及家属签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 量表调查 患者入院后行MoCA测评，主要包括定向力（地点、时间定向力）、抽象思维、延迟回忆、注意力与计算力（计算力、警觉性和顺背倒背）、语言能力（语言流畅性、重复句子和命名）、视空间执行功能（画钟、复制立方体和交替连线测验），满分为30分，MoCA总分≥26分表示患者认知功能正常。

1.2.2 功能磁共振检查 （1）弥散张量成像（DTI）采用Siemens Verio 3.0T磁共振成像仪进行颅脑扫描，由同一名经验丰富的放射科医师操作；采用单次激发自旋回波EPI脉冲序列，行轴位扫描，TR 10000 ms，TE 90 ms，矩阵128×128，FOV 256 mm×256 mm，层厚2 mm，层距0，扩散加权系数b1=0，b2=1000 s/mm2，扩散敏感梯度方向30个，扫描结束后使用SIEMENS公司提供的软件包进行DTI图像及数据资料处理，重建FA和MD图像，分别于双侧枕叶、额叶、颞叶、顶叶的形似正常白质，双侧丘脑、扣带回及胼胝体压部置感兴趣区（ROI），测量各向异性分数（fractional anisotropy，FA）和平均扩散系数（mean diffusivity，MD）。每个ROI均定位于解剖结构的最大显示层面，除胼胝体压部以外，双侧大脑半球同一解剖结构尽量采用镜面对称方式进行选取，连续测量3个相邻层面、取平均值后进行统计。所有感兴趣区均避开病灶、脑脊液区域。（2）磁共振血流量扫描（MRS）采用单体素1H-MRS扫描进行数据采集，TR=2000 ms，TE=135 ms，选取右侧额叶、左侧颞叶，测定胆碱化合物（choline，Cho）、肌酸复合物（creatin，Cr）、肌醇（myo-inositol，mI）以及N-乙酰基天门冬氨酸（N-acetylaspartate，NAA）峰值，然后分别计算NAA/Cr、Cho/Cr、mI/Cr的比值。

1.2.3 ApoE及MTHFR基因多态性检测 于入院当天抽取受试者的外周静脉血3 mL，存储在枸橼酸钠抗凝管中，-80℃冰箱中保存；基因组DNA试剂盒提取外周血白细胞DNA；ApoE、MTHFR基因（C677T）PCR扩增；PCR产物酶切；酶切片段电泳鉴定基因型。

1.3 统计学处理

所有数据均采用SPSS 19.0软件包进行统计分析，计量资料应用均数±标准差（x±s）表示，计量资料组间比较采用独立样本t检验，组间基因型及等位基因的比较采用χ2检验，采用Pearson相关分析进行相关性检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者MoCA评分比较

VCIND-SSVD组回忆力、注意力与计算力、延迟回忆、视空间与执行功能力及MoCA总分均明显低于NC-SSVD组（P<0.05）；两组患者抽象能力、语言能力、定向力评分比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 两组患者不同部位MD、FA值比较

VCIND-SSVD組胼胝体压部及双侧海马、额叶FA值低于NC-SSVD组，胼胝体压部及双侧海马MD值明显高于NC-SSVD组（P<0.05）；两组患者双侧颞叶、顶叶、枕叶、扣带回后部FA、MD值无明显差异（P>0.05），见表2。

2.3 两组患者体素部位NAA/Cr、Cho/Cr、mI/Cr比较

VCIND-SSVD组右侧额叶NAA/Cr值明显低于NC-SSVD组，左侧颞叶mI/Cr值明显高于NC-SSVD组（P<0.05），见表3。

2.4 两组患者ApoE及MTHFR基因多态性检测结果比较

VCIND-SSVD组ε3/4+ε4/4、TT基因型和ε4、T等位基因的频率均明显高于NC-SSVD组，C等位基因的频率明显低于NC-SSVD组（P<0.05）；两组患者ε2/2+ε2/3、ε3/3、CT、CC基因型和ε2、ε3等位基因的频率比较无明显差异（P>0.05），见表4。

2.5 MD、FA、NAA/Cr、Cho/Cr、mI/Cr值与MoCA评分相关性分析

双侧海马、额叶及胼胝体压部FA值与MoCA评分均呈明显负相关性（r=-0.419、-0.623、-0.582，P<0.05），双侧顶叶、颞叶、枕叶及扣带回与MoCA评分无明显相关性（r=-0.104、-0.097、-0.187、-0.116，P>0.05）；胼胝体压部及双侧海马MD值与MoCA评分均呈明显正相关性（r=0.613、0.447，P<0.05），双侧顶叶、颞叶、额叶、枕叶及扣带回MD值与MoCA评分无明显相关性（r=0.069、0.212、0.175、0.096、0.168，P>0.05）；右侧额叶NAA/Cr值与MoCA评分呈明显负相关性（r=-0.527，P<0.05），左侧颞叶mI/Cr值与MoCA评分呈明显正相关性（r=0.619，P<0.05）；右侧额叶Cho/Cr、mI/Cr值及左侧颞叶NAA/Cr、Cho/Cr值与MoCA评分呈无明显相关性（r=0.207、0.153、-0.238、0.149，P>0.05）。

3 讨论

SSVD是一组以多发腔隙性梗死和白质病变为主要脑部损害的缺血性脑血管病，因其隐匿性起病及临床表现不明显的特点导致疾病早期容易被忽视，随病情进展，可能出现血管性痴呆，发生不可逆性损害。

神经影像学作为一种无创性的检查手段，是辅助SSVD诊断和鉴别诊断的重要工具之一，主要包括DTI和MRS，其中DTI两个主要指标为FA与MD，FA反映了机体组织各向异性弥散程度的变化情况，FA值越大则说明机体神经纤维的排列越加紧密，且微细结构更好，纤维较完整，反之则提示神经纤维可能存在功能或者结构异常[7]；MD反映了水分子弥散运动快慢情况，包括髓鞘脱失、神经退变或者神经元丢失等病变均可造成水分子的运动空间明显增加，弥散加快[8]。

本研究中，VCIND-SSVD组FA值均不同程度降低，提示在长期疾病状态下VCIND-SSVD患者存在明显皮层下神经纤维束受损；而胼胝体压部及双侧海马、额叶FA值低于NC-SSVD组，提示VCIND-SSVD患者神经纤维束损害主要集中在胼胝体压部及双侧海马、额叶部。同时，VCIND-SSVD组患者的MD值在胼胝体压部及双侧海马明显升高，提示部分患者认知障碍可能是由老年、血管等因素所引起的。Xu Q等[9]应用DTI柱状图定量研究发现SIVD患者全脑组织结构异常的数目和程度与临床认知功能下降的严重性存在密切的相关。Seo SW等[10]研究显示，通过结构影像学的数据发现前额叶皮层的变薄与轻度VCI患者执行功能的下降有关。李朋等[11]的研究显示，终末期肾病患者视觉空间与执行能力、语言、延迟记忆能力受损，提示患者额叶、枕叶连接纤维可能存在结构及功能异常。本研究中，VCIND-SSVD组回忆力、注意力与计算力、延迟回忆、视空间与执行功能力及MoCA总分均明显低于NC-SSVD组，提示SSVD患者认知障碍主要集中在回忆力功能、注意力和执行功能，这与患者影像学检查结果基本一致，提示VCIND-SSVD患者双侧海马、额叶神经纤维束受损更加明显。总之，VCIND-SSVD患者脑白质广泛微结构异常，在一定程度上提供了其认知损伤的影像学诊断标记。

不过DTI反映的是超微组织结构的损害，代谢功能改变并不清楚，为了进一步获得有价值的病理生理学信息，本研究对SSVD患者的颞叶及额叶进行了MRS检查，从而尽可能地为患者结构损害提供生物化学证据。NAA主要在神经元线粒体内合成代谢，可作为神经元的标记物，主要反映神经元的密度及完整性，因此，NAA浓度降低可能是由于神经元破坏或线粒体功能失调所致，可作为判断神经元丢失和损伤的可靠指标[12]。既往研究指出[13]，Cho在神经元和射精角质细胞内均大量存在，不过星形胶质细胞和少突角质细胞内的Cho浓度明显高于神经元，因此Cho浓度升高表示与神经胶质细胞增生有关。mI是神经角质细胞的一个主要标志物，与神经元纤维和淀粉样斑块呈明显正相关性，mI升高表示神经角质增生[14]。

Nitkunan A等[15]对SIVD患者行MRS和DTI检查，探讨DTI参数异常的生物化学基础，结果发现半卵圆中心NAA与MD呈显著负相关，与FA呈显著正相关，且代谢异常与轴索丧失及认知障碍有关。本研究中，VCIND-SSVD组右侧额叶NAA/Cr值明显低于NC-SSVD组，提示存在认知障碍的SSVD患者出现了代谢功能异常变化，可能与白质纤维束受损有关；同时，VCIND-SSVD组左侧颞叶mI/Cr值明显高于NC-SSVD组，可能与老年因素、血管因素在认知障碍发展过程中的交互作用有关。因此，VCIND-SSVD患者的右侧额叶、左侧颞叶等神经元代谢功能已经出现异常。同时，进一步分线发现，双侧海马、额叶及胼胝体压部FA值、胼胝体压部及双侧海马MD值、右侧额叶NAA/Cr值、左侧颞叶mI/Cr值与MoCA评分呈显著相关性，提示双侧海马、额叶及胼胝体压部神经纤维束受损越严重，代谢功能越差，患者的认知障碍越严重。

在临床研究中，ApoEε4等位基因被认为是迟发型阿尔茨海默病、血管性痴呆的一个重要相关危险因素。早期相关项研究指出[16]，ApoEε4 等位基因同样是MCI 的危险因素。Barabash A等[17]分析ApoE基因型对认知功能障碍或认知功能障碍向阿尔茨海默病转化危险度的影响，结果显示ApoE ε4等位基因可增加MCI的危险度，其OR值达到了6.04。何璐等[18]的研究亦指出，ε4等位基因与轻度认知功能障碍存在显著正相关性。Yoo JH等[19]的研究发现MTHFR基因的C667T基因多态性和血管性痴呆有一定关系，Kim J等[20]认为C667T基因多态性与轻度认知障碍相关。本研究中，VCIND-SSVD组ApoE及MTHFR基因的等位基因分布以ε4、T为主，且明显高于NC-SSVD组。结合本研究及相关研究结果可以推测，ApoE及MTHFR基因多态性可能为SSVD患者出现认知障碍的潜在的遗传性危险因素，不过其具体作用机制仍然需要进一步研究证实。

综上所述，MRS、DTI及ApoE、MTHFR基因多态性与SSVD患者早期认知障碍有密切关系，在SSVD患者认知障碍诊断及评估中具有一定临床价值。

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（收稿日期：2016-12-02）