FXR mRNA表达量与肝恶性肿瘤复发转移关系探讨

王峥嵘+庞静欢+周艳+金剑英+徐永富+郭群依

[摘要] 目的 探讨核受体法尼醇（FXR）mRNA表达量与肝恶性肿瘤复发转移的关系。 方法 选取2013年3月～2016年3月于我院接受手术切除肝癌组织、癌周组织和正常肝组织的46例患者进行研究，依据病理学标准分为高侵袭组（n=21）和低侵袭组（n=25），分析FXR表达与肝恶性肿瘤复发转移的关系。 结果 FXR mRNA在高侵袭组中表达量显著高于低侵袭组，在肿瘤组织中表达量显著低于癌周组织和正常组织，差异有统计学意义（P<0.05）；两组术后TB、CB和总胆汁酸含量较术前显著下降，且高侵袭组手术前后TB、CB和总胆汁酸含量均显著高于低侵袭组，差异有统计学意义（P<0.05）；FXR mRNA表达量与术前TB、CB和总胆汁酸呈显著正相关（rs=0.455，P=0.038；rs=0.357，P=0.041；rs=0.348，P=0.042）。结论 肝恶性肿瘤复发转移侵袭性高时，会促进胆汁酸分泌，加剧肝内胆汁淤滞，从而上调FXR mRNA表达量，FXR可能参与抗肝恶性肿瘤复发转移过程，具体还有待进一步研究证实。

[关键词] 法尼醇X受体；原发性肝癌；肿瘤复发；肿瘤转移

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）07-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the expression of farnesol X receptor （FXR） mRNA expression and the recurrence and metastasis of hepatic malignant tumors. Methods From March 2013 to March 2016， 46 patients who received surgical resection of liver cancer tissues， peritumoral tissues and normal liver tissues were studied. According to the pathological criteria， they were divided into high invasive group（n=21） and low invasive group（n=25）， and the relationship between expression of FXR and recurrence and metastasis of malignant tumors was analyzed. Results The expression level of FXR mRNA in high invasive group was significantly higher than that in low invasive group， and the expression level in tumor tissues was significantly lower than that in peritumoral tissues and normal tissues （P<0.05）； after surgery， the levels of TB， CB and total bile acid were significantly lower than those before surgery， and the levels in high invasive group before and after surgery were significantly higher than those in low invasive group （P<0.05）； the expression level of FXR mRNA was significantly positively correlated with TB， CB and total bile acid before surgery （rs=0.455， P=0.038； rs=0.357， P=0.041； rs=0.348， P=0.042）. Conclusion Recurrence and metastasis of high invasive hepatic malignant tumors can promote the secretion of bile acid， increase intrahepatic cholestasis， and up regulate expression level of FXR mRNA. FXR may participate in the recurrence and metastasis of hepatic malignant tumors， which remains to be further studied.

[Key words] Farnesol X receptor； Primary hepatocellular carcinoma； Tumor recurrence； Tumor metastasis

膽汁淤积为肝癌常见病理症状，是肝恶性肿瘤形成的重要环节，患者出现胆汁淤积时，形成的胆汁流以及胆汁代谢障碍会增加胆汁酸等有毒物质潴留，恶化肝细胞和组织损伤，形成胆汁淤积型肝病[1-3]。核受体法尼醇X受体（FXR）参与胆汁代谢过程，可调节机体胆汁酸平衡，此外，Huang等[4]在小鼠模型中研究发现，敲除FXR基因的小鼠全部出现肿瘤，而野生型小鼠则没有，认为FXR具有促进损伤肝细胞恢复和生长，抵抗肝癌细胞扩散的作用。目前有关FXR在人肝癌复发转移方面的研究鲜有报道，本研究针对我院45例接受肝癌手术切除的患者，取其切除肝癌组织、癌周组织和正常肝组织进行研究，旨在探究FXR的表达与肝恶性肿瘤复发转移的关系，为临床治疗提供新的靶点。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年3月～2016年3月于我院接受手术切除肝癌组织、癌周组织和正常肝组织的46例患者进行研究。纳入标准：标本均经病理证实为原发性肝癌组织；入选患者均无其他恶性肿瘤；患者均为首次接受根治性肝切除术者，手术治疗前后均进行常规实验室指标检查。排除标准：合并严重心、脑、肾、肺等重要脏器病变者；手术失败者；因其他非肝炎型病变所致胆汁淤积者；资料不全者；妊娠及哺乳期妇女。本研究患者男37例，女9例，年龄35～75岁，平均（49.51±5.62）岁，其中病理类型为肝细胞癌者36例，胆管细胞癌者8例，混合型肝癌者2例；其中伴有肝硬化者24例，不伴有肝硬化者22例；癌细胞侵袭肝癌门静脉栓者9例，淋巴结转移和神经浸润者3例，肝内转移者2例，膈肌浸润者2例。本研究经我院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本处理和分组 所有患者均行肝癌根治术治疗，切除患者肝癌组织、癌周组织和少部分正常肝组织作为标本，所有标本离体后10 min内取材并放置液氮内速冻后于-80℃冰箱保存，用于后期FXR基因检测。46例患者的肝组织切除标本，根据Silva癌细胞侵袭性标准[5]，把肝组织表现为肿瘤伴多发肝内扩散，和（或）门脉主干癌栓的标本分为高侵袭组（n=21），把肝组织表现为肿瘤病灶局限、肉眼和镜下检测均无肝内扩散和门脉浸润者的标本分为低侵袭组（n=25）。

1.2.2 FXR基因检测 将预先处理好的存于-80℃冰箱的样本参照总RNA提取试剂盒（MRC，美国）说明书，用Trizol法提取肝组织样本RNA；后使用M-MLV反转录试剂盒（Promega）将所提RNA反转成cDNA，放于-20℃冰箱保存；设计扩增FXR基因和内参基因（GADPH）引物和探针（表1），参照荧光定量PCR试剂盒（ThermoFisher）说明书扩FXR和内参基因，总反应体系20 μL，所用cDNA模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，探针0.3 μL，每个样本做三个实验学重复，使用Liavak的2-△△Ct法[6]分析FXR基因相对表达量。

1.2.3 分析患者一般资料 记录两组患者手术前后血清总胆红素（TB）、结合胆红素（CB）和总胆汁酸含量，TB、CB和总胆汁酸均取患者手术前后清晨空腹静脉外周血，离心获得血清后于全自动生化分析仪上检测（日立7180型），所有检测试剂为仪器配套试剂。

1.3 统计学方法

数据采用SAS 19.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组不同切除肝组织中FXR mRNA表达量比较

FXR mRNA在高侵袭组中表达量显著高于低侵袭组，在肿瘤组织中表达量显著低于癌周组织和正常组织，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

注：与组内癌周组织和正常组织比较，*P<0.05；高侵袭组：t肿瘤组织/癌周组织=5.56，P肿瘤组织/癌周组织<0.01；t肿瘤组织/正常组织=5.72，P肿瘤组织/癌正常组织<0.01；t癌周组织/正常组织=0.78，P癌周组织/癌正常组织>0.05；低侵袭组：t肿瘤组织/癌周组织=5.38，P肿瘤组织/癌周组织<0.01；t肿瘤组织/正常组织=5.58，P肿瘤组织/癌正常组织<0.01；t癌周组织/正常组织=0.77，P癌周组织/癌正常组织>0.05

2.2 两组患者手术前后TB、CB和总胆汁酸变化

两组术后TB、CB和总胆汁酸含量较术前显著下降，且高侵袭组手术前后TB、CB和总胆汁酸含量均显著高于低侵袭组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.3 FXR mRNA表达量与术前TB、CB和总胆汁酸的相关性分析

FXR mRNA表达量与术前TB、CB和总胆汁酸呈显著正相关，相关系数分别为0.455，0357和0.348。见表4。

3 讨论

肝脏作为人体重要解毒器官，参与机体各种解毒过程，而各种代谢的毒性物质往往对肝细胞具有细胞毒性，但肝脏仍能保持较好机能，提示肝脏具有再生潜能[7，8]，Kim I等[9]研究发现，肝脏在病理状态下，会激活静息态肝细胞恢复再生能力，修复受损肝组织，促进肝功能恢复。胆汁淤积所致的胆汁酸代谢异常是引起肝损伤，导致肝癌的重要原因之一，而FXR在胆汁酸代谢过程中发挥重要作用[10]，Calkin等[11]研究发现，FXR在修复肝细胞损伤和对抗肝细胞凋亡上具有重要作用。本研究针对我院46例接受肝癌根治性切除术患者，取其切除组织进行研究，发现FXR基因在高侵袭性肝组织中表达量显著高于低侵袭性组织，推测FXR调控的促进肝再生作用可能参与抵抗肝恶性肿瘤转移复发过程。

胆汁酸被认为是胃肠道致癌因子，许多专家在小鼠模型中研究发现，携带乙肝病毒的小鼠，胆汁酸可诱发其发生肝恶性肿瘤[12]。胆汁酸主要由肝臟分泌至胆汁，其代谢与肝脏显著相关，肝脏对血液中的胆汁酸亲和力强，几乎可将其完全吸收，当肝功能处于损伤状态时，患者循环血肿可检测到胆汁酸含量，故胆汁酸是反映肝脏损伤的重要指标[13，14]。本研究中，患者术前总胆汁酸含量上升，提示肝功能发生损伤，术后胆汁酸含量下降，说明肝功能损伤状况得到改善。此外，所有患者术前总胆红素（TB）、结合胆红素（CB）显著高出正常水平，而经过手术切除治疗后，患者TB、CB含量显著下降，说明经过手术治疗，患者体内胆汁淤积症状得到显著改善[12]。肝细胞不断参与胆红素代谢过程，保证胆红素不断清除，避免胆汁酸淤积，而当肝脏发生恶性肿瘤时，胆红素代谢平衡遭到破坏，患者TB、CB和总胆汁酸含量显著上升，而通过手术切除后，肿瘤负荷降低，患者体内胆汁淤积情况得到显著改善，故TB、CB与总胆汁酸含量下降[15]。本研究中，肿瘤高侵袭组总胆汁酸含量显著高于低侵袭组，说明肿瘤侵袭可能和胆汁酸含量具有一定相关性。核受体法尼醇X受体（FXR）具有调节胆汁酸代谢作用，本研究通过对不同侵袭组FXR的mRNA表达量检测发现，FXR mRNA在高侵袭组高表达，而在低侵袭组表达量则相对较低，提示FXR可能通过参与调节胆汁酸代谢参与肿瘤侵袭过程。FXR在肝脏、肾脏、倡导、肾上腺组织中具有高表达特性[16]，Makishima等[17]研究显示，胆酸是FXR的体内配体，结合型或者非结合型的胆汁酸均可激活FXR。FXR在高侵袭组织中高表达，究其原因，可能是肿瘤侵袭性强的组织快速增长，扰乱胆汁酸代谢平衡，胆汁酸淤积激活了FXR基因，FXR通过调节下游信号通路加强胆汁酸代谢，使肝脏免受侵袭，而此过程同时激活FXR调节肝细胞修复过程，抵抗癌细胞转移和侵袭[18]。此外，通过对FXR mRNA表达与TB、CB、胆汁酸相关性检验发现，FXR mRNA表达与术前TB、CB、胆汁酸存在显著正相关，再次证明FXR可能参与抵抗肝恶性肿瘤复发转移的推测。Fan等[19]研究显示，基因敲除FXR基因的小鼠注射致癌物后13～15个月便诱发肝恶性肿瘤，并且体内胆汁酸代谢相关蛋白表达出现异常，而对照野生型小鼠则没有发生此种情况。对敲除FXR基因的小鼠研究发现，小鼠肝内不仅诱发恶性肿瘤，肝细胞和组织也发现明显凋亡和坏死现象[20]。许多国内外专家均证实，FXF在抑制肝癌细胞增殖和肿瘤转移复发过程发挥重要作用，揭示FXF可通过反馈调节Ras/Erk和抑制p16/INK4a信号通路参与抗肿瘤过程[15]。此外，FXF具有促进肝细胞再生的功能，Huang等[4]在动物模型中研究显示，给予0.2%胆酸食物的动物组肝再生程度显著高于抑制胆汁酸分泌的动物组，而对FXF基因敲除的动物无论添加或抑制胆酸与否，均不会刺激感组织再生，说明FXF可能参与组织再生，FXR修复肝功能损伤功能一旦缺失，则会引发肝细胞功能异常，导致肝细胞损伤甚至凋亡。目前有关FXF在肝癌方面的临床研究鲜有报道，本研究虽对FXF与肝恶性肿瘤转移复发的关系做出说明，但研究结果属于间接推测，还需更进一步验证。

综上所述，肝恶性肿瘤复发转移侵袭性高时，会促进胆汁酸分泌，加剧肝内胆汁淤滞，从而上调FXR mRNA表达量，FXR可能参与抗肝恶性肿瘤复发转移过程，具体还有待进一步研究证实。

[参考文献]

[1] 陈永辉.陷胸三金汤加味治疗胆汁淤积性肝硬化疗效观察[J].四川中医，2014，32（2）：116-117.

[2] 郑晓君，谭玲，时高峰.肝脏增强CT扫描在肝癌诊断中的研究价值[J].中国CT和MRI杂志，2016，14（10）：80-82.

[3] 张玉平，黄飞舟，罗宏武，等.DDR1基因在不同复发倾向肝癌患者中的表达水平差异及在肝癌临床预后中的价值[J].医学临床研究，2016，33（2）：286-289.

[4] Huang W，Ma K，Zhang J，et al. Nuclear receptor-dependent bile acid signaling is required for normal liver regeneration[J].Science，2006，312（5771）：233-226.

[5] Silva J，Dasgupta S，Wang G，et al. Lipids isolated from bone induce the migration of human breast cancer cells [J]. Journal of Lipid Research，2006，47（4）：724-733.

[6] Livak KJ，Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CT method [J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[7] 李文剛，王齐.肝硬化合并非酒精性脂肪肝与肝纤维化程度关联性研究[J].湖南师范大学学报（医学版），2015，12（4）：41-43.

[8] 王玉泽，张海丛，张冬，等.乙型肝炎病毒对非酒精性脂肪肝患者肝功能及血清中成纤维细胞生长因子21的影响[J].解放军医药杂志，2016，28（1）：62-65.

[9] Kim I，Morimura K，Shah Y，et al. Spontaneous hepatocarcinogenesis in farnesoid X receptor-null mice [J]. Carcinogenesis，2007，28（5）：940-946.

[10] 张冠军，史小莲，郭曼曼，等.新型FXR激动剂MT2005改善大鼠胆汁淤积作用[J].中国药理学通报，2015，31（B11）：252-252.

[11] Calkin AC，Tontonoz P.Transcriptional integration of metabolism by the nuclear sterol-activated receptors LXR and FXR [J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2012，13（4）：213-224.

[12] 路亮，姚矾，李自生，等.血清总胆汁酸和血清及胃液肝纤维化四项指标在胃癌、胃溃疡中的意义[J].国际消化病杂志，2014，34（4）：286-287.

[13] 顾国妹，何峻峰，杨乐梅.血清总胆汁酸测定在肝脏疾病中的应用[J].河北医药，2014，36（23）：3626-3627.

[14] 刘庆蓉，夏庆杰.原发性肝癌患者血清转铁蛋白、前白蛋白和总胆汁酸与肝脏储备功能的关系[J].华西医学，2014，29（10）：1883-1886.

[15] 李燕，王贵祥，王红蕾，等.总胆红素总胆汁酸前白蛋白与肝脏疾病相关性研究[J].河北医学，2014，20（1）：151-154.

[16] 吴海滨，佘世锋，兰绍阳.基于FXR探讨茵栀黄注射液利胆退黄的机制研究[J].辽宁中医杂志，2016，43（4）：845-848.

[17] Makishima M，Okamoto AY，Repa JJ，et al. Identification of a nuclear receptor for bile acids[J].Science，1999，284（5418）：1362-1365.

[18] Wang YD，Chen WD，Huang WFXR.A target for different diseases[J].Histology & Histopathology，2008，23（5）：621-627.

[19] Fan Y，Huang X，Yi T，et al. Spontaneous development of liver tumors in the absence of the bile acid receptor farnesoid X receptor [J].Cancer Research，2007，67（3）：863-867.

[20] Fujino T，Takeuchi A，Marukoohtake A，et al. Critical role of farnesoid X receptor for hepatocellular carcinoma cell proliferation [J].Journal of Biochemistry，2012，152（6）：577-586.

（收稿日期：2016-11-07）