转化生长因子α-435G/A基因多态性与非酒精性脂肪性肝病相互关系研究

邓家征，申 洋，凌 晶，邓 宏，乐永红，庄小芳

·非酒精性脂肪性肝病·

转化生长因子α-435G/A基因多态性与非酒精性脂肪性肝病相互关系研究

邓家征，申 洋，凌 晶，邓 宏，乐永红，庄小芳

目的 研究转化生长因子（TGF）α-435G/A基因多态性与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发病之间的相互关系。方法选取我院2013年2月至2015年2月收治的NAFLD患者126例作为研究对象，同时以121例正常人作为对照组，采用限制性片段长度多态性（RFLP）分析法对上述研究对象外周血TGFα-435G/A基因进行多态性分析，所获得的数据采用SPSS软件进行分析。结果NAFLD患者TGFα-435G/A基因型与等位基因的分布与对照组之间并无显著性差异，但是NAFLD患者中AA和GG基因型频率（39.2%和16.3%）和等位基因频率（61.4%和38.6%）与对照组之间（分别为25.7%和 35.3%，和45.2%和54.8%）存在显著性差异（x2=15.43，P＜0.05；x2=16.32，P＜0.05）；进一步的研究表明，不同程度NAFLD患者AA、AG、GG基因型频率和等位基因频率也存在一定的差异，即重度脂肪肝患者纯合体（AA和GG）比例相对较高。结论TGFα-435G/A多肽位点基因突变与NAFLD患者发病之间存在一定的关联性，且不同基因型频率和等位基因频率与病情存在一定的相关性。

非酒精性脂肪性肝病；转化生长因子α；基因多态性；基因型；等位基因

目前，脂肪肝已经逐渐成为继艾滋病、吸毒、酗酒之后的第四大医学和社会问题[1]，并且已经成为继病毒性肝炎之后的第二大肝病。《2012年度世界卫生统计报表》显示，全球罹患脂肪肝的患者大约为1亿3千万人，并以每年将近1.4%速度迅速增长。根据我国对脂肪肝的调研结果显示，截止到2014年我国罹患脂肪肝的患者总数大约在3400万至3500万之间，并以每年接近2.5%的速度递增，说明我国面临着较为严峻的脂肪肝防治形势。Targher G et al[2]研究指出，脂肪肝的诱发因素很多，但是其最终结果都会导致人体肝细胞内脂肪类物质的非正常过量堆积，进而引发疾病[3]。黄健[4]认为非酒精性脂肪肝患者在脂肪肝患者当中占有较大的比例，已经成为研究治疗脂肪肝的重要方向。非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种无过量饮酒史，以弥漫性肝细胞脂肪变性以及脂类物质富集作为主要特征的肝脏疾病[5]。研究结果表明，转化生长因子（transfor ming growth factor-β1，TGF-β1）在人体内可以直接参与肝脏等部位脂类物质的转移，或者通过相应的信号转导机制促使相关部位脂类物质的转移[6]，因此其可能与脂肪肝的形成以及恶化相关。叶晓光等[7]研究指出，TGFα与肝病的慢性化以及肝功能损害之间具有明显的相关性，其在一定程度上可以作为检测指标。TGF-α和TGF-β对于慢性肝炎、肝硬化病情的判断具有重要的临床意义[8]。在本研究中，我们检测了脂肪肝患者血清TGFα-435G/A基因多态性，以探讨TGFα-435G/A基因多态性与脂肪肝之间的相互关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取我院自2013年2月至2015年2月收治的非酒精性脂肪肝患者126例作为研究对象，男性73例，女性53例，平均年龄（48.2±23.5）岁。上述患者均根据《肝脏病学》的诊断标准诊断。另选健康人121例，男性61名，女性60名，平均年龄（46.8±24.7）岁。

1.2 血清TGFα mRNA检测 清晨抽取静脉血8 ml，取4 ml放置于肝素抗凝管中，-80℃保存，用于DNA提取。剩余血液用于相关生化指标检测。引物设计及PCR反应：应用olige 7.0软件对TGFα进行引物设计，其序列如下：F：TGATGGGCGTGTGG AG，R：GTCGAGCCGGTGTGG。上述引物由上海生物工程有限公司合成。以提取的DNA为模板进行PCR反应（所用试剂均购自TAKARA公司)，其反应体系（25 μl）如下所示：ddH2O 16.9 μl，10× Buffer 2.5μl，dNTP 2 μl（250 μmol/l），F 0.8 μl（0.5mmol/l），R 0.8 μl（0.5mmol/l），DNA 1 μl， DNA聚合酶（LA）1 μl。PCR反应程序为95℃5 min，95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环，72℃ 5 min，4℃。对获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后在凝胶成像仪下观察。基因型判断：取上述PCR产物5 μl，加入2 μl Pst1限制性内切酶，然后加入2 μl 10×buffer和11 μl灭菌蒸馏水，37℃水浴1 h。取6 μl酶切后产物，加入1 μl 6×buffer，并在8%非变形聚丙烯酰胺凝胶中电泳1 h（100 V，40 mA），然后通过凝胶成像系统进行观察。PCR产物测序：随机选取不同基因的野生型、杂合子和突变纯合子各3例PCR产物。送交上海生工公司进行测序与分析。

1.3 脂肪肝分度[9]1）轻度脂肪肝：在进行B超检测时，表现为近场回声增强，远场回声衰减不明显，肝内管状结构仍然可见；2）中度脂肪肝：在B超检测时，表现为前场回声增强，后场回声衰减，肝内管状结构模糊，患者有较为明显的肝区不适，食欲不振现象；3）重度脂肪肝：在进行B超检测时，表现为近场回声显著增强，远场回声明显衰减，肝内管状结构无法辨认，且患者肝区有明显的疼痛感觉或黄疸，肝功能检查显示中度或者重度肝功能异常。

1.4 统计学方法 等位基因频率=（纯合子例数× 2+杂合子例数）×2-1×n-1[9]。所有统计数据应用SPSS 20.0软件进行分析，计数资料采用x2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TGFα-435G/A基因PCR电泳及测序结果 对获得的PCR产物经Pst1限制性内切酶（识别位点为CTGCAG）处理后电泳。TGFα-435G/G基因型能够被Pst1限制性内切酶切割，因此电泳之后其电泳结果有95 bp和73 bp两个条带。TGFα-435A/A基因型不能被Pst1限制性内切酶切割，因此电泳后只有168 bp一个条带。TGFα-435G/A基因型经Pst1限制性内切酶切割后有168 bp、95 bp和73 bp三个条带（图1A）。PCR酶切结果与测序结果一致（图1B）。

2.2 NAFLD患者与健康人基因型频率和等位基因频率比较 对脂肪肝与健康人等位基因G、A频率、基因型AA、GG频率进行统计学检验，结果表明，两组之间存在显著性差异（x2=15.43，P＜0.05；x2=16.32，P＜0.05）。对两组基因型频率以及等位基因频率验证结果表明其符合Hardy-Weinberg平衡定律（表1、表2）。

图1 TGFα-435G/A基因PCR-RFLP电泳以及测序结果

表1 两组TGFα-435G/A基因型频率分布（%）比较

表2 两组TGFα-435G/A等位基因频率分布（%）比较

2.3 不同程度脂肪肝患者基因型频率和等位基因频率比较 对轻中重度脂肪肝患者基因型（AA、GG）频率和等位基因（G、A）频率进行统计学检验，结果表明不同程度脂肪肝患者之间在基因型和等位基因频率之间存在显著性差异（x2=16.45，P＜0.05；x2=15.78，P＜0.05），对脂肪肝患者基因型频率和等位基因频率进行验证结果表明其符合Hardy-Weinberg平衡定律（表3、表4）。

表3 不同程度脂肪肝患者TGFα-435G/A基因型频率分布（%）比较

表4 不同程度脂肪肝患者TGFα-435G/A等位基因频率分布（%）比较

3 讨论

相关文献[10]研究证明，目前TGFα至少包含有TGFα1、TGFα2、TGFα3等3个亚型，且各个亚型之间碱基序列相差不大。Vongsuvanh R et al[11]指出，在TGFα这三个亚型当中，相比于其他两个亚型在人体中的含量而言，TGFα1蛋白在人体内占有主要成分，这也导致在TGFα各个亚型之间TGFα1对人体的作用最为明显。Avraham et al[12-14]研究表明TGFα基因位于17q12.6-q12.8，并且在1985年由Derynck[15]通过实验首次克隆得到，经验证其含有7个外显子。刘益娟等[16，17]通过相关临床以及动物学实验表明，在人体内TGFα是一类极为活跃的多功能的细胞因子，可以参与机体多项生命活动，例如业已有实验证明[18]，TGFα基因与创伤、器官纤维化、炎症和肿瘤等的发生以及恶化存在一定的关联性，在人体肿瘤细胞的转移、受伤部位组织纤维化和发病初期的预防等方面均具有重要的作用。例如Dwan M[19]的研究表明，TGFα基因在癌症以及肿瘤发生中可能扮演不同的角色。Nseir W研究表明[20]，在肿瘤前期TGFα可以通过对细胞周期的调控来抑制体内肿瘤细胞的增殖，进而抑制肿瘤的恶化，而在肿瘤发生中后期，其在一定程度上可以通过免疫抑制来促进肿瘤细胞在机体内的扩散和转移[21]。这些研究结果均表明TGFα可能在人体内部肿瘤以及癌症等疾病的发生以及恶化当中发挥一定的作用，因此加深对TGFα在不同肿瘤中的研究并在此基础上探究其与肿瘤细胞之间相互关系，对于肿瘤患者疾病的治疗具有重要的现实意义。近年来，随着人们生活方式的不断改变以及人们生活水平的不断提升，在日常饮食当中由于不良的饮食习惯例如过度饮酒、暴饮暴食等都会在很大程度上导致脂肪肝等疾病的产生，虽然目前已有大量实验表明TGFα与脂肪肝等疾病发病之间存在一定的相关性，但是对于TGFα多态性与脂肪肝之间相互关系的研究却鲜见报道。

在本研究中，我们发现脂肪肝患者 TGFα-435G/A基因型和等位基因分布与健康人之间存在显著性差异（P＜0.05），说明脂肪肝的产生与TGFα基因型和等位基因的分布相关。对于不同基因型频率和等位基因频率的调查结果显示，与正常人比，脂肪肝患者AA、GG基因型频率和等位基因频率存在显著性差异，提示脂肪肝的产生与TGFα基因频率和等位基因频率存在密切的相关性。通过对不同程度脂肪肝患者的进一步研究结果表明，不同程度脂肪肝患者TGFα基因频率和等位基因频率存在显著性差异，重度脂肪肝患者纯合体（AA、GG）比例相对较高，说明TGFα-435G/A基因多态性与非酒精性脂肪肝发病之间存在密切的相关性，即有较高的AA、AG、GG基因型频率和等位基因频率者，在一定程度上会促进非酒精性脂肪肝的产生，而纯合体（AA、GG）基因型频率和等位基因频率的升高在一定程度上会促进非酒精性脂肪肝的恶化。由于研究时间短以及实验条件的限制，对于TGFα不同基因型频率和等位基因频率与非酒精性脂肪肝之间具体作用机制和方式方面还需要进一步研究。

[1]闫道普，孙宁.中西医结合治疗脂肪性肝病的认识与思考.中国新药杂志，2011，20（22）：32-35.

[2]Targher，GF，Marchesini MG.Increased risk ofcardiovascular disease in non-alcoholic fatty liverdisease：causaleffector epiphenomenon.Diabetologia，2008，51（11）：1947-1953

[3]Tokushige K，Hashimoto E，Noto H，et al. Influence of adiponectin gene polymorphisms in Japanese patients with non-alcoholic fatty liver disease.J Gastroenterol.2009，44（9）：976-982.

[4] 智陛雯，赵龙凤，王艳.TGF-β509C/T位点基因多态性与非酒精性脂肪肝病的关系.中国医疗前沿，2011，1（6）：33-34.

[5]赖晓波，聂玉强，李瑜元，等.非酒精性脂肪肝患者瘦素基因G2548A位点多态性与胰岛素抵抗的关系-附107例报告.新医学，2008，39（12）：781-782.

[6]Yang Z T，Zhang XX，Kong XF，etal. Polymorphisms of microsomal triglyceride transfer protein in different hepatitis B virus-infected patients.World J Gastroenterol.2008，14（35）：5454-5460.

[7]叶晓光，廖云珍.肝病患者血清当中TFGα含量与肝功能的关系研究.临床肝胆病杂志，2001，17（5）：83-84.

[8]吕小平，詹灵凌.慢性肝病患者血清TFG-α和TGF-β的检测及意义.广州医科大学学报，2002，19（5）：626-627.

[9]Hajiaghamohammadi AA，Ziaee A，Samimi R.The efficacy of licoricerootextractin decreasing transaminase activitiesin non-alcoholic fatty liver disease：A randomized controlled clinical trial.Phytother Res，2012，26（9）：1381-1384.

[10]倪培华，应雅韵，张洁，等.肝脂酶启动子250G/A多态性与血脂的关系.检验学，2005，6（20）：565-567.

[11]Golbidi S，Laher I，Magri CJ.Exercise induced adipokine changes and the metabolic syndrome.J Diabetes Res，2014：726861.

[12]Liu S，Wu HJ，Zhang ZQ，et al. The ameliorating effect of rosiglitazone on experimental nonalcoholic steatohepatitis is associated with regulatingadiponectin receptorexpression in rats.Eur J Pharmacol，2010，650（1）：384-389.

[13]Giby VJ，Ajith TA.Role of adipokines and peroxisome proliferator-activated receptorsin nonalcoholicfatty liverdisease. World J Hepatol，2014，6（8）：570-579.

[14]Wang C，Yan Y，Hu L，etal.Rapamycin-mediated CD36 translationalsuppression contributesto alleviation ofhepatic steatosis.Biochem Biophy Res Commun，2014，447（1）：57-63.

[15]Soresi M，Noto D，Alberto AB，et al. Nonalcoholic fatty liver and metabolic syndrome in Italy：resultsfrom a multicentric study of the Italian Arteriosclerosis society.Acta Diabetologica，2013，（2）：241-249.

[16]刘益娟.非酒精性脂肪肝患者发生2型糖尿病危险因素分析及脂肪肝的程度与血糖控制情况的相关性研究.福建医科大学学报，2010，23：142-146.

[17]朱立红，倪培华，应雅韵，等.血脂与肝脂酶启动子514C/T多态性的关系.诊断学理论与实践，2005，4：439.

[18]Anty R，Marjoux S，Tran A.Regular coffee but not express of drinking is protective againstfibrosis in a cohortmainly composedof morbidly obese Europeanwomen withNAFLD undergoing bariatric surgery.J Hepatol，2012，57（5）：1090-1096.

[19]Torres DM，Williams CD，Harrison SA.Features，diagnosis，and treatment of nonalcoholic fatty liver disease.Clin Gastroenterol Hepatol，2012，10（8）：837-858.

[20]Nseir W，Mograbi J，Ghali J.Lipid-lowering agents in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis：Human studies.Dig Dis Sci，2012，57（7）：1773-1778.

[21]He XP，Xu XW，Zhao SH，et al. Investigation of leptin1 as a candidate gene for fat deposition in pigs.Mol Biol Rep，2009，36（5）：1175-1180.

（收稿：2015-11-20）

（本文编辑：陈从新）

Transforming growth factor-α-435G/A gene polymorphism in patients with nonalcoholic fatty liver diseases

Deng Jiazheng1，Shen Yang1，Ling Jing1，Deng Hong1，Le Yonghong2，Zhuang Xiaofang2.1 Department of Internal Medicine of Deyang People's Hospital，Deyang 618000，2 Department of Hepatology，Traditional Chinese Medicine Hospital，Urumqi 830000，Xinjiang Uygur Autonomous Region，China

ObjectiveTo study the transforming growth factor α（TGF-α）-435G/A gene polymorphism in patients with nonalcoholic fatty liver diseases（NAFLD）.Methods 126 patients with NAFLD between February 2013 and February 2015 were recruited in our hospital，and 121 healthy individuals were also included at the same time as control.The polymorphism of TGF-α-435G/A gene in peripheral blood was analyzed by restriction fragment length polymorphism （RFLP）and the data obtained were processed by SPSS software.Results There was no significant difference neither in the TGFα-435G/A genotypes nor the distribution of TGFα-435G/A allele between patients with NAFLD and control（P>0.05），however，there were significant differences in AA and GG genotype frequency（39.2%vs.25.7%，and 16.3%vs.35.3%）and their allele frequency（61.4%vs.45.2%，and 38.6%vs.54.8%）between the two groups（x2=15.43，P<0.05；x2=16.32，P<0.05）；And further study showed that patients with NAFLD with different steatosis had different AA GG，AG genotype frequencies and their allele frequencies with relatively high percentage of homozygote（AA，GG）in patients with severe fatty liver diseases. Conclusions There is a certain correlation between the gene mutation of TGFα-435G/A and the incidence of NAFLD，and the frequency of different genotypes and allele might be related to the severity of NAFLD.

Nonalcoholic fatty liver disease；Transforming growth factor α；Gene polymorphism；Genotype；Allele

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.01.017

618000四川省德阳市人民医院消化内科（邓家征，申洋，凌晶，邓宏，）；乌鲁木齐市新疆维吾尔自治区中医院肝病科（乐永红，庄小芳）

邓家征，男，43岁，大学本科，副主任医师。研究方向：消化内科常见病诊治研究。E-mail：254528425@qq.com