柴胡解毒汤联合阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞亚群和细胞因子的变化

肖玉柱

柴胡解毒汤联合阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞亚群和细胞因子的变化

肖玉柱

目的 分析柴胡解毒汤联合阿德福韦酯片治疗慢性乙型肝炎（CHB）患者体内病毒水平与外周血淋巴细胞亚群和细胞因子的变化的关系，为临床治疗CHB患者提供新的思路。方法2013年12月至2015年3月间我院收治的CHB患者60例，被分为A组、B组和C组。给予A组服用柴胡解毒汤治疗，给予B组服用阿德福韦酯片，C组在B组基础上，服用柴胡解毒汤治疗。3组均观察12 m。采用ELISA法检测血清HBV标记物和血清IL-2水平，采用荧光定量PCR法检测血清HBV DNA水平，使用贝克曼库尔特流式细胞仪检测T细胞亚群和自然杀伤细胞百分比。结果在治疗12 m末，C组患者HBV DNA阴转率、ALT复常率和HBeAg阴转率分别为85.00%、80.00%和80.00%，均显著高于A组（分别为50.00%、65.00%和45.00%）或B组（分别为65.00%、55.00%和50.00%，P＜0.05）；C组患者外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD4+/CD8+细胞比值分别为（65.2±9.6）%、（28.4±7.2）%和（1.1±0.3），与A组【分别为（57.5±8.7）%、（45.7±5.4）%和（1.8±0.6）】或B组【（55.7±6.3）%、（23.2±9.5）%和（0.9±0.1）】比，差异显著（P＜0.05）；C组患者外周血CD8+T细胞为（25.3±4.1）%，显著低于B组[（28.7±4.3)%, P＜0.05]；C组患者外周血NK细胞与A组或B组比，无显著性差异（P＞0.05），但血清IL-2水平【（3.6±0.8）ng/mL】显著高于B组【（2.8±0.5）ng/mL，P＜0.05】；A组CD4+T细胞增加与HBV DNA载量减少呈显著正相关（P＜0.05）；C组CD3+T细胞增加、CD8+T细胞减少、NK细胞增加与HBV DNA载量减少呈正相关（P＜0.05）。结论柴胡解毒汤联合阿德福韦酯片治疗慢性乙型肝炎患者可调节外周血淋巴细胞比例失调，打破免疫耐受，恢复肝功能，提高抗病毒效果。

慢性乙型肝炎；柴胡解毒汤；阿德福韦酯；淋巴细胞亚群

有研究指出，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的免疫耐受及慢性化与患者自身免疫状态密切相关[1]。免疫功能紊乱及免疫耐受是慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）患者治疗的难点，采用抗病毒药物治疗CHB患者临床疗效仍有待提高，HBV易突变且不易清除[2]。目前，CHB的发病及发生机制尚未完全阐明，且临床上仍缺乏特异性的治疗方案，主要通过提高患者自身免疫力，增强免疫功能，以提高HBV清除率[3]。阿德福韦酯是现阶段在临床上应用较广的治疗CHB药物，但单独使用该药临床效果仍不十分理想[4]。有学者指出，使用中药联合阿德福韦酯对CHB患者进行治疗，可能提高疗效[5]。柴胡解毒汤是传统的治疗实火型或湿热型胆道感染的中药方剂，主要起到通里攻下、疏肝清热的作用。我们应用柴胡解毒汤联合阿德福韦酯片治疗CHB患者，检测了外周血淋巴细胞亚群和细胞因子水平的变化，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 我院2013年12月至2015年3月间收治的CHB患者60例，男性31例，女性29例，年龄27～46岁，平均年龄（35.8±10.9）岁。平均病程（5.4±2.1）年。符合《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准[6]。排除标准：（1）存在心、脑疾病或糖尿病；（2）处于哺乳或妊娠期妇女；（3）合并自身免疫性肝病、失代偿期慢性肝病、遗传性肝病；（4）合并感染其他肝炎病毒或艾滋病病毒；（5）对核苷类药物过敏者。将患者分成3组，3组年龄、性别、病程等一般临床资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。患者签署知情同意书。

1.2 治疗方法 给予A组患者柴胡解毒汤，组方为：柴胡15 g、赤芍30 g、蛇舌草30 g、垂盆草30 g、茵陈30 g、白术20 g、田基黄20 g、山药20 g、草河车15 g、土茯苓15 g、仙灵脾15 g、连翘15 g、凤尾草15 g、黄芩10 g、生茜草10 g、土鳖虫10 g。每日1剂，水煎，分早晚2次服用，治疗12 m；给予 B组阿德福韦酯片（代丁，天津药物研究院药业公司）10 mg口服，1次/d，治疗12 m；给予 C组阿德福韦酯和柴胡解毒汤，用法同上，治疗12 m。

1.3 观察指标 在治疗前和治疗结束后4 w，采集患者空腹静脉血5 ml，室温静置10 min，使用离心机（Thermo）3000 r/m离心10 min，收集血清，采用ELISA法检测血清HBV标记物（上海生工生物有限公司）和血清IL-2水平（上海生工生物有限公司），所有操作均参照试剂盒说明书进行；采用荧光定量PCR法检测血清HBV DNA水平，使用DA-620型（达安生物工程公司）检测仪及其配套试剂。

1.4 外周血T细胞亚群和自然杀伤细胞检测 采集空腹静脉血5 ml，使用流式细胞仪（CytoFLEX，贝克曼库尔特）检测T细胞亚群和自然杀伤细胞百分比。

1.5 统计学方法 应用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，采用t检验，采用直线相关分析HBV DNA载量与淋巴细胞或细胞因子的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 疗效情况 本组治疗结果显示，C组患者血清HBV DNA阴转率、ALT复常率和HBeAg阴转率均显著高于A组或B组（P＜0.05，表1）。

表1 三组疗效（%）比较

2.2 三组患者治疗前后T细胞亚群变化情况的比较 结果显示，治疗前各组患者T细胞亚群无明显差异（P＞0.05）；治疗后A组患者CD3+、CD4+T细胞百分比和CD4+/CD8+比值显著升高（P＜0.05），CD8+T细胞显著降低（P＜0.05）；B组治疗前后T细胞亚群无显著性变化（P＞0.05）；C组患者CD3+T细胞和CD4+/CD8+比值显著升高（P＜0.05），CD8+T细胞百分比显著降低（P＜0.05）；治疗后，C组患者CD3+T细胞百分比显著高于A组和B组（P＜0.05），三组患者CD4+T细胞存在显著性差异（P＜0.05），B组患者CD8+T细胞显著高于A组和C组（P＜0.05），三组患者CD4+/CD8+比值存在显著性差异（P＜0.05，表2）。

表2 三组治疗前后T细胞亚群（%，±s）的变化

表2 三组治疗前后T细胞亚群（%，±s）的变化

与A组或B组比，①P＜0.05

例数 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+A组 治疗前 20 51.6±11.9 27.4±6.4 29.4±5.5 0.9±0.3治疗后 20 57.5±8.7 45.7±5.4 24.3±5.2 1.8±0.6 B组 治疗前 20 53.7±8.8 25.0±8.4 30.4±6.4 0.8±0.1治疗后 20 55.7±6.3 23.2±9.5 28.7±4.3 0.9±0.1 C组 治疗前 20 52.3±12.3 26.0±6.9 31.2±7.3 0.9±0.2治疗后 20 65.2±9.6① 28.4±7.2① 25.3±4.1① 1.1±0.3①

2.3 三组治疗前后NK细胞和IL-2水平比较 结果显示，治疗前三组患者NK细胞及IL-2水平无显著性差异（P＞0.05）；治疗后B组和C组患者NK细胞均显著升高（P＜0.05），A组和C组患者血清IL-2水平均显著升高（P＜0.05）；治疗后，三组患者NK细胞差异无统计学意义（P＞0.05），但B组患者血清IL-2水平显著低于A组和C组（表3）。

表3 三组治疗前后NK细胞和IL-2水平（±s）比较

表3 三组治疗前后NK细胞和IL-2水平（±s）比较

与A组或C组比，①P＜0.05

例数 NK细胞（%） L-2（ng/mL）A组 治疗前 20 24.1±6.1 2.8±0.6治疗后 20 25.1±5.4 3.4±0.6 B组 治疗前 20 23.8±4.7 2.3±0.7治疗后 20 26.4±3.8 2.8±0.5①C组 治疗前 20 24.7±4.3 2.4±0.5治疗后 20 27.4±3.9 3.6±0.8

2.4 HBV DNA载量与淋巴细胞变化的相关性分析情况 分析发现，A组CD4+T细胞增加与HBV DNA载量减少呈显著正相关（P＜0.05）；C组CD3+T细胞增加、CD8+T细胞减少、NK细胞增加与HBV DNA载量减少呈正相关（P＜0.05）。

3 讨论

现阶段，临床治疗CHB患者主要采用抗病毒、免疫调节、抗纤维化和改善肝功能等疗法，其中抗HBV治疗是最为关键和主要的治疗方法[7-9]。彻底清除患者体内HBV是治疗的理想状态，但诸多因素导致HBV在体内极难被彻底清除，其中病毒DNA半衰期较长，且现阶段一线抗病毒药仅能控制病毒的复制，无法从根本上彻底清除HBV是主要原因之一[10-12]。大量研究指出，CHB患者机体易出现免疫耐受且病毒DNA与宿主染色体可出现整合等都是无法彻底清除HBV的原因[13，14]。阿德福韦酯片是目前临床上应用较为广泛的抗HBV药物。药理学研究发现，阿德福韦酯主要通过作用于逆转录酶而起到阻断和抑制病毒复制的作用，进而在短时间内降低HBV DNA载量，改善肝功能，提高ALT复常率[15，16]。但也有研究指出，该药也存在作用时间短、HBeAg血清学转换率低、易耐药、停药后病情易反复甚至恶化等缺点，限制了其广泛应用[14]。

传统中医理论认为治病得扶助正气，有助于清阳升发，驱邪外出，即提高自身免疫系统功能，激发免疫应答，可有效识别感染HBV肝细胞，暴露病毒，并将其清除，以实现治疗CHB的目的[17，18]。因此，选用中药调节患者自身免疫系统，恢复免疫细胞的识别能力，再联合抗病毒药物，清除HBV是可靠的临床治疗策略[19，20]。我们结合中医理论和选用中药治疗CHB患者，可以弥补单纯西药治疗方案的不足。本研究选用柴胡解毒汤的组方为柴胡 、黄芩、赤芍、茵陈、土茯苓、凤尾草、草河车、土鳖虫、生茜草、连翘、垂盆草、蛇舌草、田基黄、白术、山药、仙灵脾等，其中柴胡即可疏肝解郁，又能清解热邪，黄芪清热利湿，赤芍泻肝火，茵陈蒿利胆退黄、利湿清热，土茯苓淡渗利湿、清热解毒，凤尾草泻热凉血、利水解毒，草河车消炎止痛、清热解毒，连翘、蛇舌草、垂盆草、田基黄清热解毒，以上药材作为主药，其余几味药为辅药，在扶正的同时还可清热解毒。

本研究结果显示，治疗后C组患者血清HBV DNA水平显著低于治疗前，A组患者CD3+、CD4+T细胞和CD4+/CD8+比值显著升高，CD8+T细胞显著降低。B组治疗前后T细胞亚群无显著性变化，C组患者 CD3+T细胞和 CD4+/CD8+比值显著升高，CD8+T细胞显著降低。B组和C组患者NK细胞均显著升高，A组和C组患者血清IL-2水平均显著升高。在A组，血清HBV DNA载量减少与CD4+T细胞增加呈正相关。在C组，血清HBV DNA载量减少与CD3+T细胞增加、CD8+T细胞减少和NK细胞增加呈正相关。结果表明，相比较于单用柴胡解毒汤或阿德福韦酯片，使用柴胡解毒汤联合阿德福韦酯片治疗CHB患者，可有效改善患者T细胞亚群异常，并提高体内NK细胞和IL-2水平，降低病毒载量，有效调节患者的免疫功能，提高疗效，增强抗HBV效果。

柴胡解毒汤联合阿德福韦酯可调节CHB患者免疫功能、打破免疫耐受、恢复肝功能、改善自觉症状、提高抗病毒效果。两种治疗药物优势互补，增强了疗效。本研究临床样本量较小，是否具有长期疗效，还有待于下一步深入研究与分析。

[1]Liu XR，Li R，Yu Xl，et al.Hepatitis B virus can be inhibited by DNA methyltransferase 3a via specific zinc-finger-induced methylation ofthe X promoter.Biochemistry，2014，79（2）：111-123.

[2]Lyu JJ，Yu S，Wang YF，et al.Anti-hepatitis B virus norbisabolane sesquiterpenoids from phyllanthus acidus and the establishmentoftheirabsolute configurationsusing theoretical calculations.J Organ Chem，2014，79（12）：5432-5447.

[3] 黄英男，吴昊.乙型肝炎肝硬化抗病毒治疗研究进展.复旦学报（医学版），2013，40（2）：233-238.

[4] 李庆，武永乐，李冰，等.慢性乙型肝炎患者外周血调节性B细胞与乙型肝炎病毒DNA定量的相关性.北京医学，2014，36（12）：1056-1057.

[5]He N，Wang F，Ma C，et al.Chemiluminescence analysis for HBV-DNA hybridization detection with magnetic nanoparticles based DNA extraction from positive whole blood samples.J Biomed Nanaotechnol，2013，9（2）：267-273.

[6]中华医学会肝病学分会和感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）.实用肝脏病杂志，2016，19（3）：Ⅴ-ⅩⅩⅢ.

[7]Li MR，Xi HL，Wang QH，et al.Kinetics of serum HBsAg in Chinese patients with chronic HBV infection with long-term adefovir dipivoxil treatment. Chin J Med，2014，127（11）：2101-2104.

[8]胥萍，陈慧，吴敏娟，等.乙型肝炎患者外周血HBV抗原抗体表达及病毒载量与T细胞亚群检测分析.现代检验医学杂志，2013，28（3）：44-47.

[9]史贵秀，赵新平，褚建伟，等.替比夫定对慢性HBV感染孕妇CD4+CD25+调节性T细胞的影响.国际医药卫生导报，2014，20（18）：2811-2815.

[10]矫淑媛，张学平.HBsAg定量与HBV-DNA联合检测在慢性乙型肝炎中的临床意义.标记免疫分析与临床，2015，22（12）：1245-1247，1213.

[11]Xu L，Yin W，Sun R，et al.Liver type i regulatory T cells suppress germinal center formation in HBV-tolerant mice.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（42）：16993-16998.

[12]吴杭源，尤德宏.替比夫定对e抗原阳性慢性乙型肝炎患者外周血NK细胞水平的影响.现代中西医结合杂志，2013，22（6）：621-622.

[13]卢林，曾令伟.调节性T淋巴细胞在乙型肝炎慢性化过程中的作用.重庆医学，2013，42（4）：459-461.

[14]李松，崔丽安，施伯安，等.柴胡解毒汤治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床研究.陕西中医，2015，36（9）：1136-1137.

[15]侯珊珊，赵远红.循经辨治腮腺混合瘤的经验.江苏中医药，2015，47（10）：25-26.

[16]Xu Y，Wu XN，Shi YW，et al.Baseline hepatitis B virus DNA level is a promising factor for predicting the 3rd month virological response to entecavir therapy：A study of strict defined hepatitis B virus Induced cirrhosis.Chin J Med，2015，128（14）：1867-1872.

[17]祖述臣.大柴胡汤加减联合西医疗法治疗脑卒中.吉林中医药，2015，35（11）：1115-1117.

[18]李娜，马翠翠，李楠，等.“清热解毒、消肿排脓”法联合刺络、中药足浴治疗急性化脓性扁桃体炎疗效观察.现代中西医结合杂志，2015，24（14）：1510-1512.

[19]Song GJ，Rao HY，Feng B，et al.Association between CISH polymorphisms and spontaneous clearance of hepatitis B virus in hepatitis B extracellular antigen-positive patients during immune active phase.Chin J Med，2014，127（9）：1691-1695.

[20]赵蕊，赵跃，曲美晶，等.疏肝解毒汤治疗慢性乙型病毒性肝炎疗效观察.陕西中医，2014，35（2）：170-171.

（收稿：2016-07-11）

（本文编辑：陈从新）

Changes of peripheral blood T lymphocyte subsets and IL-2 in patients with chronic hepatitis B receiving Bupleurum Jiedu decoction combined with adefovir dipivoxil therapy

Xiao Yuzhu.Department of Liver Diseases，Infectious Disease Hospital，Tangshan 063000，Hebei Province

s】Objectives To investigate the changes of peripheral blood T lymphocyte subsets and IL-2 in patients with chronic hepatitis B（CHB）receiving Bupleurum Jiedu decoction combined with adefovir dipivoxil（ADV）therapy.Methods 60 patients with CHB were recruited in our hospital between December 2013 and March 2015.They were treated with Bupleurum Jiedu decoction in group A（n=20），with ADV in group B（n=20）and with both in group C（n=20）.All regimens lasted for 12 months.Serum HBV markers and IL-2 were detected by ELISA，and T lymphocyte subsets and natural killer cells were detected by flow cytometry.Results At the end of 12-month treatment，the serum HBV DNA loss，ALT normalization rate and HBeAg negative rate in group C were 85.00%，80.00%and 80.00%，much higher than in group A（50.00%，65.00%and 45.00%，respectively）or in group B（65.00%，55.00%and 50.00%，respectively，P<0.05）；the proportion of peripheral CD3+T cells and CD4+T cells and ratio of CD4+/CD8+cells in groups C were（65.2±9.6）%，（28.4±7.2）%and（1.1±0.3），significantly different as compared to those in group A 【（57.5±8.7）%，（45.7±5.4）%and（1.8±0.6），respectively or group B（55.7±6.3）%，（23.2±9.5）%and（0.9±0.1），respectively，P<0.05]；the proportion of CD8+T cells in group C was（25.3±4.1）%，much lower than in group B [（28.7±4.3）%，P<0.05]；the proportion of NK cells in group C was not significantly different as compared to that in group A or in group B（P>0.05），while serum IL-2 level【（3.6± 0.8）ng/mL】was much higher than in group B【（2.8± 0.5）ng/mL，P<0.05】；the increased CD4+T cells was positively correlated to serum HBV DNA lossin group A（P<0.05）and the increased CD3+T cells，decreased CD8+T cells and increased NK cells were positively correlated to serum HBV DNA loss in group C（P< 0.05）.Conclusions The application of Bupleurum Jiedu decoction combined with adefovir dipivoxil can adjust lymphocyte dysfunction，break immune tolerance and improve the recovery of liver functions.

Hepatitis B；Herbal medicine；Adefovir dipivoxil；Peripheral lymphocyte subsets

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.01.010

063021河北省唐山市传染病医院肝病科

肖玉柱，男，43岁，医学学士，主治医师。E-mail：tsxiaoyuzhu@163.com