微生物发酵提高黄芪中黄酮类物质含量的研究

刁欢，张珍，余伟群，刘洁

(安徽新华学院药学院，安徽 合肥 230088)

微生物发酵提高黄芪中黄酮类物质含量的研究

刁欢，张珍，余伟群，刘洁

(安徽新华学院药学院，安徽 合肥 230088)

以黄芪为原料，研究微生物固态发酵对黄芪中黄酮含量的影响。采取单因素和正交试验，研究发酵时间、发酵温度、菌种接种量、发酵pH值对黄芪中黄酮含量的影响。单因素试验结果表明，发酵温度32℃、发酵时间5d、接种量为2mL时发酵效果较好；再选择其中影响显著的因素设计三因素三水平的正交试验，确定各因素水平的优劣，实验结果表明，最佳发酵工艺为A3B3C2，在该工艺条件下黄酮含量最高为0.586mg/g，是未发酵对照组(0.255mg/g)的2.29倍，增幅较大。

黄芪；微生物发酵；黄酮；含量

黄芪是一种益气托毒的常用药，有利尿、益气固表、排脓等作用，其主要成分有黄酮、氨基酸、多糖、皂苷、微量元素等[1]。黄芪含有多种的黄酮类化合物，而黄酮在中医领域验证可增强人体免疫功能、降低血糖、增强心肺功能和降血压功能，同时还具有抗衰老、抗肿瘤等功效[2]。不少真菌在发酵的过程中产生多种酶类，且酶活力强[3]。将微生物的固态发酵技术应用于中药发酵，就是利用微生物发酵过程中产生的复杂酶系，一方面可以促进中药材中纤维、蛋白质、糖类等成分的高效利用，还可以对某些特殊成分进行转化，产生出具有多种活性成分的制剂或新药材，同时一些中药还可能会促进或抑制微生物的某些次生代谢产物的的产生[4]。郭羽等利用酵母菌发酵黄芪药材，试验结果表明发酵对黄芪中多糖含量有一定影响，其产率与传统法相比有提高[5]；郝红梅等研究报道表明，利用酵母菌发酵黄芪可有效提高黄酮的产率[6]。陶蕾等研究黑曲霉发酵对黄柏中游离小檗碱影响时发现，通过黑曲霉发酵会使黄柏中的游离小檗碱含量升高[7]。也有研究表明米曲霉发酵的紫米中总酚和总黄酮含量与对照组相比大幅提高，分别增加到93.0%和122.50%[8]。本研究以黑曲霉来发酵黄芪，以温度、时间、pH值、黑曲霉接种量为影响发酵工艺研究的4个因素，设计单因素和正交试验，研究黑曲霉固态发酵黄芪的最佳条件，从而提高黄芪中黄酮的含量，具有深远的社会、经济和环境效益。

1 材料与仪器

1.1 材料

黄芪选购于市售药房，产地为甘肃；黑曲霉来源于合肥学院生物系，血粉购于南宁饲料市场，葡萄糖(AR)，琼脂(AR)，蒸馏水，无菌水，亚硝酸钠(AR)，磷酸氢二钾(AR)，氯化钾(AR)，硫酸镁(AR)，氢氧化钠(AR)，乙醇(AR)，硝酸铝(AR)，芦丁标准品(购于合肥博美生物科技有限公司)。

1.2 仪器

FA2004型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)，HH-2型数显恒温水浴锅(常州市华普达教学仪器有限公司)，721分光光度计(南通市长江光学仪器有限公司)，DPH120恒温培养箱、振荡培养箱(上海三发科学仪器有限公司)。

1.3 培养基

1) 种子培养基(PDA培养基) 土豆200g，切碎，煮沸，纱布过滤，加葡萄糖20g，溶液补充水至1000mL。115℃灭菌25min。

2)发酵培养基 称取黄芪粉末10g，血粉2g，磷酸氢二钾0.016g，硫酸镁0.008g混匀置于50mL锥形瓶中，加蒸馏水16mL，搅拌均匀，制成固态发酵培养基，121℃灭菌20min。

1.4 菌种活化

挑取斜面保存菌体，于50mL的液体PDA培养基中进行菌种活化，活化时间24h，得到活化种子菌液。

2 实验方法

2.1 黄酮提取方法

供试品制备采用乙醇回流提取法，参照文献[6]：称取黄芪10g于500mL的圆底烧瓶中，加70%乙醇溶液240mL混合，在80℃水浴下回流提取2h，趁热抽滤，收集滤液，将残渣通过80%的乙醇溶液20mL洗涤，然后过滤，最后将滤液合并。将滤液转移至100mL的容量瓶中，用30%的乙醇溶液定容，作为供试品，备用。

2.2 黄酮含量测定

1)芦丁标准曲线的绘制 称取经干燥恒重的芦丁标准品20mg，加30%的乙醇溶液溶解定容于50mL的容量瓶中，得到浓度为0.400g/L的芦丁对照品溶液，标准曲线制作具体方法参照文献[6]和文献[9]。最后以不加芦丁标准液定容好的溶液作参比，在波长510nm处用紫外可见分光光度计测定吸光度，以吸光度值A为纵坐标，芦丁浓度C(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，并用最小二乘法进行线性回归，得吸光度A与芦丁浓度C(mg/mL)之间的线性回归方程式为：A=13.175x-0.0342，相关系数为R2=0.9968，见图1。

图1 芦丁标准曲线

2)黄酮含量测定 参照1)芦丁标准曲线的绘制，并以不加芦丁标准液定容好的溶液作参比，在波长510nm处用紫外可见分光光度计测定吸光度。黄酮含量=原料中提取黄酮类物质的总质量/提取原料总重。根据公式计算得未经发酵的对照组总黄酮的含量为0.255mg/g(以不经发酵的黄芪作为对照组)。

2.3 发酵工艺单因素试验考察

1)发酵温度考察 以黑曲霉接种量2mL，发酵时间为5d，pH=5，分别在26、28、30、32、34℃下进行培养，以未经发酵的黄芪作为对照组，研究发酵温度对黄酮含量的影响。

2)发酵时间考察 以黑曲霉接种量2mL，发酵温度为28℃，pH=5，分别进行发酵1、3、5、7、9d的培养，以未经发酵的黄芪作为对照组，研究不同发酵时间对黄酮含量的影响。

3)发酵pH值考察 以黑曲霉接种量2mL，发酵温度为28℃，发酵5d，分别在pH值为4、5、6、7、8下进行培养，以未经发酵的黄芪作为对照组，研究发酵pH值对黄酮含量的影响。

4)接种量考察 以发酵温度28℃、发酵时间为5d，发酵pH值为5，分别按照黑曲霉接种量(孢子数达到108的种子液)1、2、3、4、5mL进行接种，以未经发酵的黄芪作为对照组，研究不同黑曲霉接种量对黄酮含量的影响。

表1 因素与水平

2.4 发酵工艺正交试验设计

在单因素基础上，考察影响显著的发酵温度、发酵时间、pH值3个因素对黄芪中总黄酮得率的影响，采用L9(33)正交设计，因素水平见表1。

3 结果

3.1 单因素试验结果

1)发酵温度考察结果 发酵温度对黄酮含量的影响结果，如图2。由图可知，在不同发酵温度下，黄酮含量分别为0.274、0.538、0.453、0.581、0.532mg/g。随着发酵温度的提高，黄酮含量先增加后又降低，28℃和32℃的黄酮含量相对较高，32℃后呈现出明显的下降趋势。微生物的生长和代谢产物的生成，都需要各种酶来催化。温度是影响酶活的重要因素，温度升高，酶活反应速度加快。但与之相反，酶也容易因为受热而失去活性，最终会减少物质产量。发酵温度在32℃时黄酮含量最高，是对照组的2.28倍，28～32 ℃可能是相对比较适合的发酵温度范围。

2)发酵时间考察结果 发酵时间对黄酮含量的影响结果，见图3。由图3可以看出，不同发酵时间里，黄酮含量分别为0.334、0.533、0.584、0.371、0.211mg/g。随着时间增加，1～3d黄酮含量大幅增加，3～5d时含量增加平稳，第5天含量最高达0.584mg/g。但是发酵天数达到5d以后，随着发酵天数的增加，黄酮含量却显著下降。发酵时间是影响发酵结果的一个重要因素，发酵时间短，微生物产生酶量相对较少；相反发酵时间过长，培养基所能提供的养分不足以及细胞衰亡，有可能会使产酶的性能下降，影响产量。因此本实验较适宜的发酵天数为3～5d。

图2 发酵温度对黄酮含量的影响 图3 发酵时间对黄酮含量的影响

3)发酵pH值考察结果 发酵pH值对黄酮含量的影响结果，如图4。由图4可以看出，不同pH值条件下，黄酮含量分别为0.351、0.559、0.564、0.477、0.263mg/g。pH值4～6，黄酮含量有较明显的增长，在发酵pH=6时含量最大，是对照组的2.2倍。pH值7～8时，含量出现明显下降，说明较适宜的发酵条件应偏酸性。

4)黑曲霉接种量考察结果 黑曲霉接种量对黄酮含量的影响结果，如图5。由图5可以看出，不同接种量条件下，黄酮含量分别为0.255、0.548、0.553、0.551、0.549mg/g。在黑曲霉接种量2～5mL，增加接种量对黄酮含量无显著影响。菌种接种量是相对于发酵量而言的，在发酵量一定的条件下，增加菌种的接种量，会使含量有所提高。但是随着接种量的一直增加，当达到较适宜的比例时，便不会有所提高。因此本着节约资源，充分利用的原则，本实验接种量范围选择2mL。

图4 发酵pH值对黄酮含量的影响 图5 黑曲霉接种量对黄酮含量的影响

实验号因素A温度/℃B时间/dC(pH)黄酮含量/(mg·g-1)11110.25121220.47831330.52542120.45852230.32462310.47273130.56383210.47193320.586k11.2541.2721.194k21.2541.2731.522k31.621.5831.412R0.3660.3110.328

3.2 正交试验考察结果

研究最佳发酵工艺，在单因素试验的基础上，设计了三因素、三水平的正交试验，采用L9(33)方案设计， 以得出固态发酵黄芪黄酮含量的最佳发酵工艺。 正交试验结果见表2 。

根据正交试验结果确定各因素水平的优劣，最佳试验方案是A3B3C2；因素影响程度的主次依次为A>C>B。最佳发酵条件为发酵温度32℃、发酵时间为5d、发酵pH值为6，最佳发酵工艺下黄酮含量最高为0.586mg/g，与对照组相比，提高2.29倍。根据试验结果作方差分析，结果表明各因素间差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 方差分析表

4 讨论

黑曲霉发酵过程中可以产生多种活性较强的酶系，如淀粉酶、酸性蛋白酶等[9]，细胞壁的纤维等物质会被这些丰富的酶系代谢，可能会促进黄酮的释放。经微生物发酵后黄芪中黄酮的含量有所增高，发酵后期菌种可能代谢出了黄酮类成分，而另一部分黄酮被消耗或是经修饰转化为其他物质，所以黄酮含量不会一直增加，还有可能会下降[6]。发酵温度对黄酮含量影响较大，随着温度的升高，发酵过程中可能破坏了黄芪细胞壁的完整性，提高了细胞壁的通透性，促进了黄酮的释放；发酵温度高于32℃时不适宜黑曲霉菌丝体的生长，也会破坏菌种中酶的活性，使得黄酮的含量反而降低。黑曲霉的生长和发酵过程中需要偏酸的环境，且也可能会代谢出一些有机酸，所以偏酸性的pH值环境比较适合黄芪的发酵。黄芪发酵过程中，黑曲霉产生代谢反应复杂多样[10]，且黄芪本身含有的活性成分很多，而药效作用是由活性物质决定，所以还应进一步的探讨，验证发酵的深层次结果。

黄芪中的有效成分较多，本试验仅对黄芪发酵后黄酮含的量进行了测定。结果表明，黑曲霉发酵处理可使黄芪总黄酮含量有明显的提高。通过单因素试验和正交试验，获得最佳发酵工艺A3B3C2，即发酵温度32℃、发酵时间5～d、发酵pH值为6，最佳发酵工艺下黄酮含量最高为0.586mg/g，与对照组相比，提高2.29倍。

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[编辑] 一凡

2017-01-03

2015年国家星火计划项目(2015GA710052)；2015年安徽省省级创新创业训练项目(AH201512216003、AH201512216004)；安徽省级质量工程项目(2015ckjh115)。

刁欢(1982-)，女，讲师，博士生，主要从事微生物发酵研究，532045301@qq.com。

R282.7;R917

A

1673-1409(2017)08-0004-04

[引著格式]刁欢，张珍，余伟群，等.微生物发酵提高黄芪中黄酮类物质含量的研究[J].长江大学学报(自科版)，2017，14(8)：4～7.