共同沉默DcR3和EGFR基因对结肠癌细胞株SW480体外生长的影响

杨树钢， 林建安， 陈绍勤， 叶建新

共同沉默DcR3和EGFR基因对结肠癌细胞株SW480体外生长的影响

杨树钢， 林建安， 陈绍勤， 叶建新

目的 探讨共同沉默诱骗受体3(DcR3)和表皮生长因子(EGFR)基因对结肠癌细胞株SW480生长增殖的影响和诱导凋亡作用研究。 方法 根据DcR3、EGFR的cDNA序列构建3组针对DcR3和EGFR的siRNA，分别使用脂质体Lipofectamine 2000转染的方法将各个siRNA导入结肠癌细胞株SW480中，48 h后通过实时荧光定量PCR检测各个siRNA对肿瘤靶基因mRNA表达的影响，采用Western-blot技术检测其靶基因蛋白的表达水平，筛选出对人结肠癌SW480细胞系中DcR3和EGFR抑制效果最强的siRNA，然后单独或联合转染SW480细胞，MTT法检测转染后对结肠癌细胞株SW480生长增殖活性的影响，流式细胞仪检测对结肠癌细胞株SW480的诱导凋亡作用。 结果 共同沉默DcR3和EGFR基因对SW480细胞增殖的抑制作用优于DcR3或EGFR单基因沉默组(P<0.05)。双基因共沉默组、DcR3单基因沉默组、EGFR单基因沉默组转染48 h后转染细胞的凋亡率分别为(20.1±1.7)%，(16.5±2.2)%及(15.9±1.3)%，差别具有统计学意义(P<0.05)。 结论 DcR3和EGFR双基因共沉默能有效抑制人结肠癌细胞株SW480的增殖并诱导其凋亡，且作用优于DcR3或EGFR单基因沉默。

受体，肿瘤坏死因子，成员6b； 受体，表皮生长因子； 结肠肿瘤； *基因； *基因沉默； 细胞凋亡； 细胞增殖

结直肠癌是威胁人类生命和健康的常见肿瘤之一。近年来，结肠癌的发病率与死亡率呈明显上升趋势[1]。目前，肿瘤外科手术治疗、放射治疗、内科治疗(化学药物治疗、生物治疗)和基因靶向治疗相结合的个体化综合治疗模式是优化结肠癌治疗效果所推崇的模式。分子靶向治疗成为近年来肿瘤治疗发展领域的研究热点，越来越受到重视，单基因靶向治疗结肠癌已获得一定进展，但处于一个平台期，因此联合共同作用于肿瘤细胞中的多个癌基因是肿瘤基因治疗中一个新的研究方向[2]。诱骗受体3(decoy receptor 3, DcR3)是由Pitti等发现的可溶性肿瘤坏死因子受体超家族成员，能够对细胞生长发育和分化进行调节，诱导肿瘤细胞的上皮-间质转化，与肿瘤的增殖和迁移侵袭能力关系密切，可作为肿瘤恶化的一种重要生物学标志物[3-6]，临床应用前景广阔。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是酪氨酸激酶受体家族中的一种跨膜受体，介导的信号转导对肿瘤细胞的增殖、分化、生存、转移等起调节作用，EGFR及其配体网络已经明确为肿瘤治疗的重要靶点[7]，EGFR抑制剂西妥昔单抗以其高选择性和低毒性的优势而在临床被广泛应用，可获得确切的临床效果[8]。RNA干扰是一种封闭基因表达的有效方法，通过siRNA诱导的基因沉默现象，与反义寡核苷酸技术相比能更高效地抑制目的基因的表达，具有高度特异性、高效、稳定的特点[9-10]。

本研究根据DcR3、EGFR的cDNA序列分别构建针对DcR3和EGFR的siRNA，通过siRNA共沉默人结肠癌细胞株SW480的DcR3和EGFR基因与沉默单个基因的作用效应进行比较，研究共同沉默DcR3和EGFR基因对人结肠癌细胞株SW480的增殖活性和凋亡状态的影响，初步探讨双基因靶点抑制在结肠癌基因治疗中的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞株：结肠癌细胞株SW480(武汉大学细胞典藏中心)。主要试剂：转染试剂脂质体LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)；荧光定量PCR试剂盒[TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司]；MTT试剂(美国Sigama公司)；Purified anti-human DcR3抗体、Purified anti-human EGFR抗体和Purified anti-human β-actin多克隆抗体(美国Santa公司)；细胞凋亡试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG二抗(北京中山生物技术公司)。主要仪器：PCR仪(AB2720型，美国ABI公司)；紫外光透射分析仪(ZF-B型，上海长明光学电子仪器厂)；Gene Genius凝胶成像系统(英国Syngene公司)；Uhmspec 4 300 pm紫外/可见分光光度计(Amersham 公司)；Mini-Protein垂直蛋白电泳仪(Bio-Rad公司)；CMIA多功能北航彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学);Biotek酶标仪(Applied Biosystems公司)等。

1.2 方法

1.2.1 人结肠癌细胞SW480的鉴定及siRNA合成、转染、筛选 (1)细胞培养。将人结肠癌细胞SW480培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，细胞成单层贴壁生长，以0.25%胰蛋白酶消化贴壁传代，按1∶2或1∶3传代，加入培养液后在37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养。(2)DcR3、EGFR siRNA序列的设计、合成。根据DcR3 mRNA的序列初步选择siRNA序列[11]。(3)转染与筛选。细胞转染：转染前一天，以每孔3×105～5×105个细胞接种在6孔板，用2 mL含10% FBS的RPMI 1640细胞培养基培养。在250 μL的RPMI 1640无血清培养基中加入100 pmol siRNA，柔和混匀，用无血清的RPMI 1640细胞培养基稀释5 μL Lipofectamine试剂，siRNA和RNAi-Mate试剂混合形成siRNA/Lipofectamine复合物。将500 μL siRNA/Lipofectamine复合物加入每个孔中，将细胞置于37 ℃的CO2培养箱中温育24～48 h后，进行转染后的其他检测步骤。(4)通过Real-time筛选siRNA。总RNA的提取按TRIzolTM(美国Invitrogen公司)试剂盒说明进行，所得RNA样品采用紫外分光光度计测定在260 nm和280 nm的吸光度值，即OD260 nm及OD280 nm值，算出OD260 nm/OD280 nm，并计算其浓度及纯度。用荧光定量RT-PCR检测DcR3、EGFR的表达并筛选出干扰效果较好的DcR3和EGFR siRNA。将3对DcR3-siRNA及3对EGFR-siRNA序列分别转染人结肠癌细胞SW480，24 h后收集细胞进行荧光定量PCR，检测处理前后DcR3与EGFR基因的表达情况，并将DcR3-siRNA分为DcR3对照组和DcR3-179、DcR3-641、DcR3-1027组，将EGFR-siRNA分为EGFR对照组和EGFR-395、EGFR-1211、EGFR-1499组。运用引物设计软件设计引物如下：

DcR3(产物大小144 bp)：

前引物：5’-TCAATGTGCCAGGCTCTTC-3’

后引物：5’-GCCTCTTGATGGAGATGTCC-3’

EGFR(产物大小175～176 bp)：

前引物：5’-GAGTTAAGATTTTTTTAAGGGTCCC-3’

后引物：5’-TAACTGACATGGGTCGGCC-3’

β-actin(产物大小202 bp)：

前引物：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’

后引物：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’

通过Western-blot筛选siRNA，将结果扫描传送至计算机，采用Image-Proplus图像分析软件对结果数据进行分析，以蛋白条带的灰度扫描比值来代表蛋白的表达量。

1.2.2 细胞免疫组织化学及FAM荧光标记 应用细胞免疫化学法鉴定SW480细胞EGFR蛋白和DcR3蛋白的表达情况。在同等条件下用FAM标记siRNA和阴性对照siRNA转染SW480细胞，并在荧光显微镜下观察。

1.2.3 MTT比色试验与流式细胞学检测 实验分为对照组、脂质体组、DcR3沉默组、EGFR沉默组和EGFR-DcR3共沉默组，通过实时MTT比色试验法及流式细胞学方法，观察转染后各组对人结肠癌细胞SW480体外生长情况的影响。

2 结 果

2.1 SW480细胞EGFR和DcR3的蛋白表达 细胞免疫化学鉴定SW480细胞EGFR蛋白和DcR3蛋白的表达情况，结果显示SW480细胞EGFR和DcR3染色阳性()(图1)。

A：EGFR()；B：DcR3().图1 SW480细胞EGFR蛋白和DcR3蛋白的表达Fig 1 EGFR and DcR3 protein expression in SW480 cells

2.2 siRNA转染SW480细胞的效率分析 在同等条件下用FAM标记siRNA和阴性对照siRNA转染SW480细胞，荧光显微镜下观察结果如图2所示。

将3对DcR3-siRNA及3对EGFR-siRNA序列分别转染人结肠癌细胞SW480，24 h后收集细胞进行荧光定量PCR，检测处理前后DcR3与EGFR基因的表达情况(表1)。DcR3-siRNA处理组DcR3靶基因的mRNA表达水平分别为对照组的32%，42%及30%，与对照组比较，差别均有统计学意义(P<0.05)；EGFR-siRNA处理组EGFR靶基因的mRNA表达水平分别为对照组的48%(P<0.05)，63%(P>0.05)及39%(P<0.05)，即DcR3-179、DcR3-641、DcR3-1027、EGFR-395、EGFR-1499与对照组比较，差别有统计学意义(P<0.05)。

A：siRNA；B：siCont.图2 FAM标记的siRNA细胞转染Fig 2 FAM-labeled siRNA cell transfection

细胞转染72 h后，各组靶蛋白表达的变化如下：DcR3-179、DcR3-641及DcR3-1027 siRNA对SW480细胞的DcR3蛋白表达较对照组有显著抑制作用(P<0.05)，EGFR-395及EGFR-1499 siRNA对SW480细胞的EGFR蛋白表达较对照组有显著抑制作用(P<0.05)，而EGFR-1211 siRNA对EGFR蛋白表达的抑制作用与对照组比较，差别则无统计学意义(P>0.05);其中，DcR3-1027 siRNA和EGFR-1499 siRNA的抑制效果最好(图3)。

表1 siRNA转染后胞内DcR3及EGFR的mRNA表达水平

DcR3：诱骗受体3； EGFR：表皮生长因子受体. 与对照组比较，☆：P<0.05.

A、C：DcR3-siRNA下调SW480细胞DcR3蛋白表达；B、D：EGFR-siRNA下调SW480细胞EGFR蛋白表达. ☆☆：P< 0.01；☆☆☆：P< 0.001.图3 siRNA下调SW480细胞靶蛋白表达Fig 3 siRNA decreases DcR3 and EGFR protein expression in SW480

2.3 DCR3和EGFR基因敲减对SW480细胞增殖的抑制 通过上述过程筛选出DcR3-1027 siRNA和EGFR-1499 siRNA对SW480细胞较好的干扰效果，对靶基因mRNA表达的抑制率为70%和61%。将2种siRNA单独或联合转染入SW480细胞后，通过MTT法检测各组转染后对SW480增殖的影响，结果显示，DcR3沉默组、EGFR沉默组和共沉默组的抑制率均比对照组高，在24和48 h时差别有显著性意义(P<0.05)，且共沉默组较单独沉默组在24和48 h对细胞有更明显的抑制作用(P<0.05)，而DcR3沉默组与EGFR沉默组对细胞的抑制作用在0～72 h差别均无明显意义(P>0.05)。具体见表2及图4。

表2 MTT法测转染后的SW480细胞的吸光度

DcR3：诱骗受体3；EGFR：表皮生长因子受体. 与对照组比较，☆：P<0.05.

☆：P<0.05；☆☆☆：P<0.001.图4 MTT法测SW480细胞增殖曲线Fig 4 The proliferation rate curve of SW480 in different groups

2.4 DcR3和EGFR基因敲减诱导SW480细胞的凋亡 通过流式细胞学方法检测转染后各组凋亡情况，转染后各组细胞凋亡率分别为对照组(9.4±0.9)%，脂质体组(8.8±1.2)%，DcR3沉默组(16.5±2.2)%，EGFR沉默组(15.9±1.3)%，共沉默组(20.1±1.7)%。其中DcR3沉默组、EGFR沉默组和共沉默组的凋亡率均较对照组高，差别有统计学意义(P<0.05)；共沉默组与单独沉默组比较差别也有统计学意义(P<0.05)；而DcR3沉默组与EGFR沉默组的凋亡率差别则无统计学意义(P>0.05)，具体见图5。

3 讨 论

DcR3在调节肿瘤细胞增殖、凋亡中起重要作用，一方面可通过与死亡因子FasL特异性结合，抑制FasL与受体Fas的结合，影响Fas/FasL途径诱导产生的细胞凋亡作用，使恶性肿瘤细胞逃避免疫细胞攻击；另一方面可通过与肿瘤坏死因子超家族成员淋巴毒素类似物(LIGHT)紧密结合，抑制LIGHT与受体HVEM/TR2和LTI3R的相互结合，抑制LIGHT介导的细胞凋亡作用，在肿瘤细胞的免疫逃逸中发挥着重要的作用[12]。DcR3在恶性肿瘤组织中的表达水平高于正常组织，其表达水平与肿瘤恶性程度、肿瘤大小、临床分期、肿瘤浸润和转移密切相关[13]。本研究证实，经转染DcR3-siRNA的SW480结肠癌细胞，其DcR3 mRNA及蛋白表达均降低。使用针对DcR3抑制效果较好的siRNA转染SW480细胞，肿瘤细胞的增殖受抑制，凋亡增加，提示靶向抑制DcR3可能作为结肠癌的一种潜在的治疗方法。

EGFR是细胞表面受体表皮生长因子家族(EGF family)中的一种重要的细胞表面多功能跨膜蛋白分子[14]，由其介导的信号转导对肿瘤细胞的增殖、分化、生存、转移等起调节作用[15]。EGFR能够通过激活MAPK、PI3K/AKT、及TAK-STAT信号转导通路，对调控细胞周期的CDK-cyclin系统产生影响，加快细胞的增殖、转化。当EGFR过度表达时，EGFR能够与其配体EGF结合形成一个自分泌环路，使EGFR活性明显上调，促进肿瘤细胞生长，而EGFR抗体治疗的主要机制就是通过阻断EGF/EGFR自分泌环起治疗作用。本实验将针对EGFR的siRNA转染SW480细胞，结果显示，3组针对EGFR的siRNA对人结肠癌SW480细胞的靶基因的mRNA抑制分别为61%，37%和52%。筛选出其中对EGFR抑制效果最好的siRNA转染SW480细胞，细胞凋亡率显著增加，呈现细胞生长抑制作用。

分子靶向治疗是目前肿瘤研究的热点，逐渐受到肿瘤医生的高度重视，但仍以阻断单一分子为主。然而肿瘤的发生、发展是多种基因共同参与的复杂过程，涉及到多个基因表达的异常升高。因而，针对单一分子的治疗疗效往往无法获得满意疗效。同样，针对基因治疗，多靶点联合沉默肿瘤相关基因的治疗思路将逐渐取代针对单一基因的治疗[16]。由于RNAi抑制基因表达具有特异性和高效性2个明显的特征，因而，RNAi技术被广泛用于敲减肿瘤细胞靶基因的表达，用于抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭等。研究证明，在同一个细胞内采用多个siRNA抑制多个目标基因的表达是可行的[17]。多基因共沉默技术已应用于肺癌、喉癌、胰腺癌及皮肤癌等肿瘤的基础研究，并取得明显效果，如Shi等通过联合沉默K-ras和Akt2 2个癌基因，探索RNA干扰技术用于胰腺癌的治疗作用[18]。

A～E：对照组、脂质体组、DcR3沉默组、EGFR沉默组和共沉默组细胞流式法检测； F：各组细胞凋亡率. ☆：P<0.05； ☆☆：P<0.01；☆☆☆：P<0.001.图5 DcR3和EGFR基因敲减诱导SW480细胞的凋亡Fig 5 DcR3 and EGFR gene down-regulation induced SW480 cell apoptosis

本实验选择联合沉默EGFR和DcR3基因，利用脂质体同时转染分别针对EGFR和DcR3的siRNA，且在siRNA设计时排除2种siRNA序列之间的相互干扰。结果发现，DcR3和EGFR双基因共沉默与单基因沉默相比，细胞增殖明显受抑制，细胞凋亡明显增加，且共沉默的作用明显强于DcR3和EGFR的单基因沉默。DcR3可抑制FasL/Fas途径和LIGHT与受体HVEM/TR2和LTI3R的相互结合，抑制细胞凋亡作用；EGFR被EGF等配体激活后发生二聚体化并引发胞内段发生酪氨酸激酶活性，进一步激活下游信号通路，调节细胞生长、增殖等生理过程[19]。共同沉默2个基因可起到协同抑制作用，促使细胞增殖受抑制，凋亡明显增加。本实验结果显示:同时沉默DcR3和EGFR基因较单独沉默在抑制增殖和诱导凋亡方面更具有优势。

本研究siRNA介导DcR3和EGFR双基因共沉默为结肠癌的靶向治疗提供了体外实验依据，初步探讨联合共同作用于结肠癌细胞2个基因靶点在肿瘤靶向治疗中的可行性，为结肠癌的治疗提供了一个新的思路。

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(编辑：何佳凤)

The Effects of Co-silence of DcR3 and EGFR Genes on SW480 Cell Line Growthinvitro

YANG Shugang, LIN Jianan, CHEN Shaoqin, YE Jianxin

Department of Gastrointestinal Surgery 2 Section, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

Objective To explore the effects of co-silence of decoy receptor 3 (DcR3) and epidermal growth factor receptor(EGFR) genes on the proliferation and apoptosis of SW480 cell lineinvitro. Methods According to the siRNA design principle, three siRNA target sequences on DcR3 and EGFR genes were synthesized respectively. And siRNA was transfected into SW480 cells by Lipofectamine 2000 transfection methods. Real-time qPCR and Western-blot methods were used to detecte the mRNA and protein expression of DcR3 and EGFR of the SW480 cells after transfection for 48 hours. The highest inhibition efficiency siRNA sequences were selected and then transfected into SW480 cells using control-siRNA, DcR3-siRNA, EGFR-siRNA or DcR3-EGFR-siRNA co-silence. MTT method was used to measure cell proliferation and the flow-cytometry method was used to determine cell apoptosis rate after transfection. Results The highest inhibition rate on SW480 proliferation was co-silence of DcR3 and EGFR genes group compared with DcR3-siRNA or EGFR-siRNA group(P<0.05). And the DcR3-EGFR-siRNA co-silence group apoptosis rate(20.1±1.7)% were significantly increased compared with DcR3-siRNA group (16.5±2.2)% or EGFR-siRNA group(15.9±1.3)% (P<0.05). Conclusion Co-silence of DcR3 and EGFR genes can inhibit cell proliferation and induce cell apoptosis more effectively than DcR3 or EGFR genesilence singly.

receptors, tumor necrosis factor, member 6b; receptor, epidermal growth factor; colonic neoplasms; *genes; *gene silencing; apoptosis; cell proliferation

2016-10-11

福建省教育厅科技项目(JA10146)；福建省科技计划重点项目(2014y0021)

福建医科大学 附属第一医院胃肠外科二区，福州 350005

杨树钢，男，主治医师，医学硕士

叶建新. Email: yjx0201@vip.sina.com

R394； R394.114； R394.2； R735.35

A

1672-4194(2017)01-0024-06