氢化可的松对慢性功能性内脏痛的抑制作用

唐 影， 崔子芝， 丁 运， 林宇斌， 林自力， 林 春

氢化可的松对慢性功能性内脏痛的抑制作用

唐 影1， 崔子芝1， 丁 运2， 林宇斌2， 林自力2， 林 春1

目的 探究氢化可的松(HYD)对新生期结直肠扩张所致的慢性功能性内脏痛大鼠的痛敏反应的影响及其可能的作用途径。 方法 SD大鼠出生后第8～14天行结直肠扩张，8周龄后采用腹壁撤退反射评分(AWR)和痛阈测定筛选出具有慢性内脏痛的肠易激综合征(IBS)大鼠，并随机分为4组：生理盐水组、低剂量、中剂量和高剂量HYD组；未经结直肠扩张处理的大鼠为对照组。通过AWR和痛阈测定尾静脉注射HYD前后大鼠痛敏反应程度变化；采用酶联免疫吸附法测定大鼠血清中皮质醇的含量及脊髓胸腰段和腰骶段内啡肽、脑啡肽的含量；行旷场实验测定大鼠心理焦虑程度。 结果 (1)IBS组大鼠血清中皮质醇的含量显著低于对照组大鼠(P<0.05)；(2)IBS组大鼠注射中剂量和低剂量HYD后痛阈均值比注射前显著升高(P<0.05)；(3)与生理盐水组比较，低剂量HYD组大鼠脊髓胸腰段内啡肽、脑啡肽含量显著升高(P<0.05)；(4)旷场实验显示,IBS组大鼠注射低剂量HYD后大鼠运动总路程增加，平均速度加快(P<0.05)。 结论 一定剂量的HYD能减轻大鼠的痛敏反应和焦虑抑郁行为，其机制可能与脊髓胸腰段内啡肽、脑啡肽含量变化有关。

肠易激综合征； 氢化可的松； 内啡肽； 脑啡肽； 抑郁； 焦虑

以肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)为代表的慢性功能性内脏痛以腹痛、腹胀、粪便性状改变为典型表现[1]，严重影响患者生活质量，但其发病机制尚未明确。最新的流行病学调查研究显示，IBS的发生与心理精神疾病(包括抑郁、焦虑等)的高发病率相关[2-3]。也有研究表明，慢性疼痛与抑郁焦虑障碍大多有共病的现象[4]。临床上使用抗抑郁的药物缓解疼痛，而针对IBS的治疗尚缺乏有效药物。以氢化可的松(hydrocortisone, HYD)为代表的糖皮质激素主要用于解热镇痛。研究表明，糖皮质激素能提高由慢性应激诱导所致疼痛大鼠的痛阈值[5]。对于慢性疼痛患者在常规治疗的基础上增加糖皮质激素类药物治疗可以提高治疗的效果，有效缓解患者的疼痛[6]。

本研究拟通过对新生幼鼠给予结直肠扩张(colorectal distension，CRD)建造慢性功能性内脏痛的IBS大鼠模型[7]，观察IBS大鼠血清皮质醇(cortisol, CORT)的含量变化，探讨静脉注射HYD是否对IBS大鼠的痛觉敏化具有抑制作用及其与脊髓内脑啡肽(enkephalin, ENK)、内啡肽(endorphin, EP)等镇痛物质浓度变化的关系，同时观察HYD对大鼠抑郁焦虑行为的影响，为临床开发新型IBS治疗药物提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 新生期SD雄性大鼠[福建医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(闽)2012-0001]，随其母置于福建医科大学实验动物中心饲养，饲养温度(22±1)℃，相对湿度60%～70%，房间压力10～50 Pa。

1.1.2 试剂 HYD(批号：1409201，天津药业集团新郑股份有限公司)；HYD试剂盒(SBJ-R0019)、EP试剂盒(SBJ-R0873)及ENK试剂盒(SBJ-R0874)[森贝伽(南京)生物科技有限公司]。

1.1.3 仪器 自发活动旷场试验和自主活动视频分析系统(RD1413型，上海移数/鼠博士公司)；酶联免疫检测仪(ELX800，USA Bio Tek Instruments Inc)。

1.2 方法

1.2.1 慢性功能性内脏痛大鼠模型建立 SD大鼠在出生后第8～14天每天接受1次压力为60 mmHg(1 mmHg=133.3 Pa)的CRD刺激1 min，待其长至8周龄(体质量约230 g)开始进行AWR评分和痛阈测定，筛选出建模成功的大鼠进行实验。造模成功的大鼠进入IBS组(n=24)并随机分为4组：生理盐水组，低剂量HYD组(2.5 mg/kg)，中剂量HYD组(5 mg/kg)，高剂量HYD组(10 mg/kg)。新生期未经CRD处理的大鼠为对照组。

1.2.2 AWR评分 待测大鼠禁食不禁水24 h后，用乙醚气麻，将气囊(长径5 cm)从肛门插入大鼠的直肠中，并将大鼠放于20 cm×8 cm×8 cm的透明塑料盒内，待大鼠清醒并适应15～20 min后通过三通管连接扩张球囊和血压计给予CRD，并调节压力。CRD分为20，40，60，80 mmHg 4个等级，每次CRD刺激持续20 s，每2次刺激间隔5 min，每个刺激强度重复3次，取3次评分的平均值为最后的评分值。评分参考如下：大鼠无明显行为改变为0分；大鼠抬头但腹部肌肉未收缩为1分；大鼠腹部肌肉收缩无拱起为2分；大鼠腹部拱起但骨盆未抬离为3分；腹部与骨盆均抬离桌面为4分。

1.2.3 痛阈测定 测定前准备工作与AWR评分相同。CRD刺激由15 mmHg开始，以5 mmHg的梯度逐渐增加，每次刺激持续20 s，每两次刺激间隔5 min。当大鼠腹壁收缩拱起时(即AWR评分为3分时)的压力值计为痛阈值，重复3次，取3次平均痛阈值作为最后的评分值。

1.2.4 旷场实验 在明亮且安静的环境中将大鼠放置在50 cm×50 cm×50 cm的敞箱中，让大鼠自由活动，用红外跟踪仪开始记录，时间为5 min。结束后将大鼠取出。系统会自动检测出总路程和平均速度。每次测试结束后用75%的酒精擦拭实验设备，消除气味后再进行下一次测试。

1.2.5 ELISA实验 HYD的检测：眼内眦静脉丛取血，室温自然凝固后离心20 min(2 000～3 000 r/min)，仔细收集上清液并加样，将标准品稀释加样做标准曲线，经温育、配液、洗涤、加酶、再温育、再洗涤、显色和终止后，将试剂盒置于酶标仪测定。

ENK及EP的检测：取脊髓胸腰段和腰骶段，将组织研磨后离心20 min(2 000～3 000 r/min)。仔细收集上清液，将标准品稀释加样做标准曲线，经温育、配液、洗涤、加酶、再温育、再洗涤、显色和终止后，将试剂盒置于酶标仪测定。

2 结 果

2.1 慢性内脏痛大鼠血清CORT含量的变化 IBS组大鼠血液中的CORT含量[(64.340±7.627)μg/L]较对照组[(109.610±20.521)μg/L]低28.75%，差别具有统计学意义(P<0.05，图1)，提示慢性内脏痛大鼠血清CORT含量显著降低。

n=10. CORT：皮质醇; IBS:肠易激综合征. 与对照组比较，☆: P<0.05.图1 对照组及IBS组大鼠血清CORT水平Fig 1 CORT level of serum in control and IBS rats

2.2 HYD对内脏痛大鼠痛敏行为的影响 IBS组大鼠内脏痛阈值显著低于对照组大鼠(P<0.05,图2)。对IBS组大鼠注射相应量的生理盐水和HYD后，生理盐水组大鼠给药前后测量的平均痛阈值比较，差别无统计学意义(P>0.05)；低剂量HYD组大鼠平均痛阈(35.28±3.00)较给药前(29.44±2.80)提高18.6%(P<0.05)，中剂量组平均痛阈(33.59±3.2)较给药前(30.00±2.80)提高了33.9%(P<0.05)，高剂量组平均痛阈(27.51±3.10)较给药前(33.46±2.90)降低了27%，加剧了痛敏反应(P<0.05，图3)。

n=10. IBS:肠易激综合征. 与对照组比较，☆: P<0.05.图2 对照组及IBS组大鼠痛阈水平Fig 2 Pain threshold in control and IBS rats

2.3 HYD对内脏痛大鼠的抑郁焦虑行为的影响 矿场实验中，IBS组注射低剂量HYD后大鼠活动总路程较注射前显著增加(P<0.05,图4A)，平均速度显著增加(P<0.05，图4B)，生理盐水组、中剂量及高剂量HYD组注射前后总路程和平均速度比较，差别均无统计学意义(P>0.05)，提示低剂量HYD可能有助于改善内脏痛大鼠的抑郁焦虑行为。

n=6. HYD：氢化可的松; IBS:肠易激综合征.NS：生理盐水组； Low：低剂量组； Mid：中剂量组； Hig:高剂量组. 与给药前比较，☆: P<0.05.图3 IBS组大鼠给予HYD前、后的痛阈水平Fig 3 Pain threshold before and after administration of HYD in IBS rats

n=6. HYD：氢化可的松； IBS:肠易激综合征.NS：生理盐水组； Low：低剂量组； Mid：中剂量组； Hig:高剂量组. A：注射不同浓度HYD对IBS组大鼠运动总路程的影响； B：注射不同浓度HYD对IBS组大鼠运动平均速度的影响. 与给药前比较，☆:P<0.05.图4 IBS组大鼠给予HYD前、后运动总路程和平均速度Fig 4 Total distance and average speeds before and after administration of HYD in IBS rats

2.4 HYD对内脏痛大鼠脊髓胸腰段和腰骶段中ENK及EP含量的影响 注射低剂量和高剂量HYD的IBS大鼠脊髓胸腰段中ENK含量与注射生理盐水组大鼠比较，差别有统计学意义(P<0.05，图5A)；注射低剂量HYD的IBS大鼠脊髓胸腰段中EP含量显著高于生理盐水组大鼠(P<0.05，图5B)；注射高、中和低剂量HYD后IBS大鼠脊髓腰骶段中的ENK含量[分别为(424.66±49.50)，(368.75±73.33)，(271.97±37.42)]与生理盐水组(341.15±62.48)比较,差别均无统计学意义(P>0.05)。注射高、中和低剂量HYD后IBS大鼠脊髓腰骶段中的EP含量[分别为(3 083.5±809.44)，(4 443.5±655.15)，(2 576.83±793.83)]与生理盐水组(3 125.17±416.74)比较，差别均无统计学意义(P>0.05)。

n=6. ENK：脑啡肽； EP：内啡肽; HYD：氢化可的松； IBS:肠易激综合征. A：注射不同浓度HYD后 IBS组大鼠脊髓胸腰段ENK的表达水平；B：注射不同浓度HYD后 IBS组大鼠脊髓胸腰段EP的表达水平. 与生理盐水组比较，☆: P<0.05.图5 给予不同浓度HYD后IBS组大鼠脊髓胸腰段ENK和EP表达水平Fig 5 ENK and EP level in the thoracolumbar segments of the spinal cord in IBS rats

3 讨 论

IBS的发病与神经内分泌因素有关[8]。有研究报道，来源于垂体分泌的内源性阿片物质如β-内啡肽等，受促肾上腺皮质激素释放因子的调节，并受肾上腺的负反馈控制，与其相应特异性受体结合后，参与应激反应并调控疼痛。同时，CORT也在一系列负反馈调节下释放，共同参与应激引起的内脏痛传出调节和行为反应等[9-11]。但关于IBS患者或大鼠体液中CORT含量变化的研究结果不尽一致[12-14]。本研究采用新生期CRD的方法建立IBS慢性内脏痛模型，发现IBS大鼠痛阈及CORT含量均显著低于对照组；低、中剂量HYD可使IBS大鼠痛阈显著升高，而高剂量HYD却使其痛阈显著降低。旷场实验显示,低剂量HYD可使IBS大鼠运动总路程增加，平均速度加快；不同剂量HYD使IBS大鼠脊髓胸腰段EP及ENK含量有不同程度升高。

旷场实验记录的动物行程、平均速度能反映其运动能力以及焦虑抑郁状态[15]。本研究中，IBS大鼠注射低剂量HYD后运动总路程及平均速度明显增加，提示注射适量HYD可缓解IBS大鼠的焦虑抑郁状态，可能与其影响多巴胺、去甲肾上腺素和5-羟色胺水平有关[16-17]。本研究中，低、中剂量的HYD对慢性功能性内脏痛IBS大鼠能产生一定的镇痛作用，而高剂量HYD却使IBS大鼠痛阈较注射前更低，考虑可能是因为血液中高浓度剂量的HYD对HPA轴的负反馈调节作用，抑制了内源性CORT的释放，从而提高了IBS大鼠的痛觉敏感性。

正常大鼠降结肠和直肠的内脏传入神经多数由盆神经投射至L6-S2脊髓节段；少量由腹下神经投射至T13-L2脊髓节段[18-19]。但研究发现，急性结肠扩张的信息是通过盆神经传入在脊髓腰骶节段进行处理，而伴有炎症或功能性肠紊乱的内脏痛觉高敏感可能是源于胸腰背根传入的敏化[20]。本研究中，注射不同浓度HYD后脊髓胸腰段EP和ENK出现不同程度的增高，而腰骶段EP和ENK水平均没有显著性改变，此结果与本课题组之前的研究结果进一步证实脊髓胸腰段在慢性功能性内脏痛中枢敏化中发挥了不可替代的作用。此外，适量注射HYD后脊髓胸腰段中镇痛物质EP及ENK的含量都明显升高，提示HYD有可能通过EP及ENK在脊髓胸腰段参与慢性内脏痛的调控，具体机制有待进一步研究。

综上，一定剂量的HYD对IBS大鼠的慢性功能性内脏痛有一定的镇痛作用，可能与脊髓胸腰段内EP及ENK的作用有关。但若一次给予过量HYD，反而提高IBS大鼠的痛觉敏感性，因此，在研制针对IBS患者疼痛的新型药物中是否可尝试加入适量的糖皮质激素增强疗效值得探讨。

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(编辑:张慧茹)

Inhibitory Effects of Hydrocortisone on Chronic Functional Visceral Pain

TANG Ying1, CUI Zizhi1, DING Yun2, LIN Yubin2,LIN Zili2, LIN Chun1

1. Fujian Medical University, Basic Medical College, Department of Physiology and Pathophysiology,Pain Laboratory, Fujian Provincial Key Laboratory of Neuroscience, Fuzhou 350122, China;2. Fujian Medical University, Basic Medical College, 2013 Seven-Year Clinical Medicine Program, Fuzhou 350122, China

Objective To explore the effects of different dosages of hydrocortisone (HYD) on the visceral hypersensitivity in rats with chronic functional visceral pain generated by neonatal colorectal distention(CRD) and their possible pathophysiological mechanisms. Methods The rat models with chronic functional visceral pain were established by CRD during post-natal days 8 to 14. Control rats did not received CRD. Abdominal withdrawal reflex(AWR)and pain threshold test were measured to evaluate the sensitivity of visceral pain in rats when they were adult (8 weeks); IBS rats were assigned to four groups at random: NS group, low-dose of HYD group, medium-dose group, and high-dose group. Effects of HYD on visceral hypersensitivity was examined by AWR and pain threshold test before and after the tail intravenous injection the drugs. ELISA was applied to test the content of serum cortisol and expression of endorphin(EP) and enkephalin(ENK) in the relevant parts of spinal cord in the rats after administration. Open field test was used to examine the psychological anxiety level of rats. Results (1)The content of serum cortisol was significantly reduced in rats with chronic functional visceral pain when compared with that in control rats (P<0.05); (2)The pain threshold of IBS rats was significantly increased after the injection of medium and low dose of HYD (P<0.05); (3)The content of EP and ENK were significantly increased in the spinal cord thoracolumbar segment after the injection of low-dose of HYD when compared with injection of saline(P<0.05); (4)Open field test showed that the total distance and average speeds significantly increased after low-dose injection of HYD when compared with before injection (P<0.05). Conclusion A certain concentration range of HYD may relieve the pain sensitization and the behavior reaction of anxiety and depression in rats with chronic functional visceral pain. The mechanism may be related to the dynamic expression of EP and ENK in the spinal cord thoracolumbar segment.

irritable bowel syndrome； hydrocortisone； endorphin； enkephalin； depression； anxiety

2016-06-27

国家自然科学基金(81471138)；福建省自然科学基金(2014J01124)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201510392023)

福建医科大学，福州 350122 1.基础医学院生理学与病理生理学系，疼痛研究室，福建省神经胶质和疾病重点实验室;2.基础医学院2013级临床七年制学生

唐 影,女,讲师,医学硕士

林 春. Email: chunlin77550@126.com

R332； R402； R965

A

1672-4194(2017)01-0001-05