超声波辅助提取茶叶总黄酮及抗氧化活性分析

吕名秀，高玉梅，董雪茹，强黎明，李玲玲

(河南工程学院 材料与化学工程学院，河南 郑州 450007)

超声波辅助提取茶叶总黄酮及抗氧化活性分析

吕名秀*，高玉梅，董雪茹，强黎明，李玲玲

(河南工程学院 材料与化学工程学院，河南 郑州 450007)

采用超声波辅助法探讨了铁观音茶叶中总黄酮的最佳提取工艺条件，并测定了铁观音茶叶总黄酮清除羟基自由基的能力. 结果表明，超声波功率400 W，料液比1∶30 g·mL-1，浸提时间30 min，乙醇浓度50%为超声波辅助提取铁观音茶叶总黄酮的最佳工艺条件，总黄酮提取率为4.74%；抗氧化实验表明随着铁观音茶叶总黄酮浓度的增大，其对羟基自由基的清除能力增大，当浓度达到0.80 g/L，清除率为65.14%，与BHT相比具有较强的抗氧化能力.

茶叶；总黄酮；超声波；抗氧化活性

茶叶是重要的世界性作物之一，广泛分布于亚洲、远东、拉美和大洋洲等地[1]. 它是世界上仅次于水的第二大饮品. 据FAO-IGG统计，2015年全球茶叶产量达到528.5万吨. 2010年以来，中国茶叶产量持续增长，2015年已达到227.8万吨，稳居世界第一产茶国的地位[2-3]. 茶叶中所含的成分很多，将近500种. 人们熟知的几种重要成分有茶多酚、黄酮类化合物、维生素C、咖啡碱、蛋白质等[4]. 另外，茶叶中还含有许多人体必需的微量元素，如钙、铁、锌、镁、碘、氟、锰、钼、硒、锗等[5-6].

许多文献报道，茶叶具有良好的抗氧化能力[7]，能抑制活性氧的形成，有效清除自由基[8]，这与其含有多种抗氧化物有关，如黄酮、儿茶素、茶黄素、没食子酸等[9]. 黄酮有很多的药理作用，已被广泛的应用于医学的临床治疗[10-13]. 黄酮具有降血压、防止动脉硬化、降血脂、清热解毒、抗氧化、强化细胞膜、活化细胞等功效[7]. 随着患有肿瘤疾病人数的增多，现代医学对黄酮的需求越来越大. 茶叶在全球分布广泛，且茶叶中总黄酮含量较高[14]. 另外，市场上使用的食品抗氧化剂大多是通过化学实验合成品(如 BHT)，存在食品安全性问题. 而天然抗氧化剂具有安全、无毒等优点[15].

以茶叶为原料，从茶叶中提取黄酮，既可满足于当代医学上、食品添加剂及化妆品对黄酮的需求，又使得茶叶得到广泛的开发利用，因此探索提取茶叶黄酮的工艺研究具有良好的经济效益和社会效益. 目前，超声波提取法在天然产物中有效成分的提取上表现出较强的优势：提取速度快、提取效率高、节约溶剂、低温进行(40～60 ℃)、操作简单易行、提取料液杂质少等[16-18]，与传统提取法相比，超声波提取法是一种实现快速、高效、环保、节能的现代新技术. 本研究将通过单因素实验和正交试验，确定超声波辅助法提取铁观音茶叶总黄酮的最佳工艺条件，同时对茶叶总黄酮进行抗氧化活性分析，为茶叶的综合开发利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

铁观音茶叶购于福建省安溪县宝隆茶业有限公司；芦丁标准品 购于南京苏朗医药科技开发有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、邻二氮菲、七水合硫酸亚铁、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、盐酸、双氧水等均为分析纯试剂.

XH-300 UL电脑微波超声波紫外光组合催化合成仪，北京祥鹄科技发展有限公司；CP 114型电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；UV-3600紫外可见近红外分光光度计，日本Shimadzu公司；DK-8 AX恒温水浴槽，上海精密仪器仪表有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理

首先要把铁观音茶叶粉碎，通过恒温干燥箱干燥至恒重，封口密封，在干燥处保存. 粉碎过40目筛、烘干至恒重，密封，在干燥处保存备用.

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制

将芦丁标准品在120℃下恒温烘干，精密称取纯度为98%的芦丁标准品10.30 mg，置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解，然后用70%乙醇定容至刻度线，摇匀，得到芦丁标准溶液[15-16]，浓度1.009 4 g/L.

精密吸取芦丁标准溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加60%的乙醇至2.0 mL；加入5%的NaNO2溶液0.4 mL，摇匀放置6 min；然后加入10%的Al(NO3)3溶液0.4 mL，摇匀再放置6 min；再加4.0 mL 5%的NaOH溶液；用70%的乙醇定容，摇晃均匀后等待10 min；最后在波长510 nm处测溶液的吸光度A(见图1). 重复3次，算其平均值.

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

1.2.3 茶叶提取物的制备

称取干燥的茶叶粉末2.00 g，加入60 mL 70%的乙醇于60 ℃水浴锅中回流提取1 h，抽滤. 滤液定容至100 mL，摇匀备用.

1.2.4 提取茶叶总黄酮的单因素试验

分别考察了超声波功率，浸提时间，乙醇的体积分数，料液比和温度等五个因素对超声波辅助法从茶叶中提取总黄酮的最佳工艺，每组试验重复3次，取平均值作图.

1.2.5 提取茶叶总黄酮的正交试验

通过比较每个因素对实验结果的影响，选取乙醇浓度、超声波功率、浸提时间及料液比四个因素为考察因素，以茶叶总黄酮提取率为考察指标，设计四因素三水平正交实验. 根据正交试验结果得出茶叶总黄酮提取率最大的工艺条件并进行验证试验[19-20]，每个试验重复3次，取平均值.

1.3 总黄酮提取率的计算方法

测定提取液的吸光度[21-22]，具体方法同1.2.2. 根据芦丁标准曲线计算茶叶总黄酮的质量浓度ρ，每组试验重复3次，取平均值，计算茶叶总黄酮的提取率.

1.4 铁观音茶叶总黄酮对·OH的清除能力测定

在10 mL容量瓶中依次加入7.5 mmol/L邻二氮菲溶液1.0 mL，50.0 mmol/L Tris-HCl (pH=7.4)溶液2.0 mL，7.5 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL，混匀后，再分别加入铁观音茶叶总黄酮浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的溶液1.0 mL，0.1%的双氧水1.0 mL，用蒸馏水定容，混合均匀后，置于37 ℃的水浴中保温1 h，在510 nm处测得Ai，当用蒸馏水替代试样得到A1，用蒸馏水替代H2O2和试样得到A0，可排除样品本身的影响，BHT作对照，Tris-HCl溶液作空白溶液，计算得到自由基清除率[23]. 每组试验重复3次，取平均值作图.

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声波功率对茶叶总黄酮提取的影响

在200～500 W范围内，改变超声波功率，测定茶叶总黄酮的提取率，结果见图2. 茶叶总黄酮的提取率随着超声波功率的增大呈现先升后降的趋势，350 W时茶叶总黄酮提取率最高，推测可能是因为超声波功率太大，能量太高，使部分总黄酮结构遭到破坏，这样就导致检测到的总黄酮含量减少. 因此，试验选择350 W作为提取茶叶总黄酮的超声波功率.

图2 超声波功率对茶叶总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of tea flavonoids

2.1.2 浸提时间对茶叶总黄酮提取的影响

由图3可以看出：延长浸提时间，茶叶总黄酮的提取率呈现先增加后减小的趋势，浸提时间为30 min时，茶叶总黄酮提取率最高. 30 min前茶叶总黄酮的提取率随时间延长而增大；30 min之后，茶叶总黄酮的提取率随时间的延长反而下降，这可能是因为时间太长，会使茶叶细胞内其他杂质进入提取液，增大传质阻力，影响茶叶总黄酮的溶出. 因此，超声波辅助下，茶叶总黄酮的最佳浸提时间为30 min.

图3 浸提时间对茶叶总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extracting time on extraction yield of tea flavonoids

2.1.3 乙醇浓度对茶叶总黄酮提取的影响

由图4可以得出：随着乙醇浓度的增大，茶叶总黄酮的提取率呈现先升后降的趋势，乙醇浓度为50%时，茶叶总黄酮提取效果最好. 当乙醇浓度大于50%时，茶叶总黄酮的提取率下降，这可能是乙醇浓度过大，茶叶中一些易溶于乙醇的脂溶性物质、色素等副产物溶出，从而减少了茶叶总黄酮的溶出量，测量结果偏低. 因次，选择50%乙醇为提取茶叶总黄酮的溶剂.

图4 乙醇浓度对茶叶总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction yield of tea flavonoids

2.1.4 料液比对茶叶总黄酮提取的影响

由图5可以得出：增加溶剂的体积，茶叶总黄酮的提取率呈现先升后降的趋势，料液比为1∶20 g·mL-1时，茶叶总黄酮的提取率最大. 但随着溶剂体积继续增大，茶叶总黄酮的提取率减小，这也许是由于随着乙醇用量的增大，许多易溶于乙醇的其他物质大量溶出，干扰了茶叶总黄酮的溶出，从而使茶叶总黄酮的提取率降低. 因此提取茶叶总黄酮的最适合的料液比是1∶20 g·mL-1.

图5 料液比对茶叶总黄酮提取率的影响Fig.5 Effects of material to liquid ratio on extraction yield of tea flavonoids

2.1.5 温度对茶叶总黄酮提取的影响

由图6可得：升高温度，在35 ℃之前，茶叶总黄酮的提取率随温度升高而迅速升高，在35 ℃之后茶叶总黄酮的提取率升高的较为缓慢，从节约能量和满足实验条件的方面来说，选择温度35 ℃恰到好处，既能满足实验所需要到的温度又减少耗能使提取茶叶总黄酮的量最多又节约了成本.

图6 浸提温度对茶叶总黄酮提取率的影响Fig.6 Effects of ethanol temperature on extraction yield of tea flavonoids

2.2 正交试验结果分析

为获得茶叶总黄酮最优的提取工艺，在单因素试验基础上，选择乙醇浓度、超声波功率、浸提时间及料液比作为考察因素，以总黄酮提取率为考察指标，按照L9(34)正交表进行正交试验，因素水平表如表1所示，正交试验结果与数据分析见表2.

表1 正交试验因素水平数

表2 正交试验结果

正交实验结果说明，不同的因素对提取率的影响是：乙醇浓度 > 超声波功率 > 料液比 > 浸提时间. 根据结果可知，超声波辅助法提取茶叶总黄酮最佳条件是：A2B3D3C2，即乙醇浓度为50%，超声波功率为400 W，浸提时间为30 min，茶叶与乙醇的料液比为1∶30 g·mL-1.

2.3 验证实验

为确定优化提取工艺的稳定性，在该工艺条件下进行3组平行实验，测得铁观音茶叶总黄酮的提取率分别为4.72%，4.74%，4.75%，平均为4.74%，此条件为铁观音茶叶总黄酮的最佳提取工艺.

2.4 清除·OH自由基能力

以BHT作为对照，测定了茶叶总黄酮清除羟基自由基能力，结果如图7所示. 茶叶总黄酮对·OH自由基的清除能力随着总黄酮浓度的增加而增大，当浓度达到0.8 g/L后，清除率为65.14%，说明茶叶总黄酮能够清除·OH自由基，且在测定浓度范围内茶叶总黄酮清除·OH自由基能力强于BHT.

图7 茶叶总黄酮和BHT对·OH的清除率Fig.7 Scavenging effects of tea flavonoids and BHT on hydroxyl radical

3 结论

采用超声波辅助法提取茶叶中的总黄酮具有良好的效果. 单因素试验和正交试验结果显示各因素对茶叶黄铜提取率的影响顺序为：乙醇浓度>超声波功率>料液比>浸提时间. 通过验证试验可知超声波辅助法提取茶叶总黄酮的最优条件为：乙醇浓度50%，超声波功率400 W，浸提时间30 min，料液比为1∶30 g·mL-1，在此条件下，茶叶总黄酮的提取率可达4.74%. 茶叶总黄酮和BHT对·OH自由基的清除能力均随着浓度增大而变强. 茶叶总黄酮能够清除·OH，且比BHT对·OH的清除能力强.

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[责任编辑：吴文鹏]

Study on ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of flavonoids from tea

LÜ Mingxiu*, GAO Yumei, DONG Xueru, QIANG Liming, LI Lingling

(SchoolofMaterialandChemicalEngineering,HenanUniversityofEngineering,Zhengzhou450007,Henan,China)

Flavonoids from Tieguanyin tea were extracted by ultrasonic method, and their antioxidant activity was determined. The results showed that the optimum extraction conditions are ultrasonic power of 400 W, material to liquid ratio of 1∶30 g·mL-1, extracting time of 30 min, ethanol concentration of 50%, and the extraction yield of tea flavonoids is 4.74%. With the increasing concentration of tea flavonoids, their antioxidant activity became greater. When the concentration of tea flavonoids reaches 0.80 g/L, clearance rate of free radical is 65.14%. The antioxidant capacity of tea flavonoids is stronger than butylated hydroxytoluene (BHT).

tea; flavonoids; ultrasonic; antioxidant activity

2016-12-29.

河南省基础与前沿技术研究计划项目(132300410307)，河南省科技攻关项目(112102310544)，河南省教育厅自然科学研究计划项目(2011A150006、2011A150007).

吕名秀(1982-)，女，讲师，研究方向为天然产物化学、化学生物学.*

，E-mail：rettyking@163.com.

TS201.1

A

1008-1011(2017)02-0213-06