基于2-(4-二羟基硼烷)苯基喹啉-4-羧酸的二硼酸化合物的合成

王 凯,张浩超,孙敬勇,姚庆强,吴忠玉

(1.济南大学 山东省医学科学院 医学与生命科学学院，山东 济南 250200; 2.山东省医学科学院药物研究所，山东 济南 250062; 3.国家卫生部生物技术药物重点实验室，山东 济南 250062; 4.山东省罕少见病重点实验室，山东 济南 250062)

基于2-(4-二羟基硼烷)苯基喹啉-4-羧酸的二硼酸化合物的合成

王 凯,张浩超,孙敬勇,姚庆强*,吴忠玉*

(1.济南大学 山东省医学科学院 医学与生命科学学院，山东 济南 250200; 2.山东省医学科学院药物研究所，山东 济南 250062; 3.国家卫生部生物技术药物重点实验室，山东 济南 250062; 4.山东省罕少见病重点实验室，山东 济南 250062)

以4-溴苯乙酮、靛红及常见试剂为起始原料，通过Pfitzinger reaction、羧基酯化、钯催化、水解等反应合成2-(4-二羟基硼烷)苯基喹啉-4-羧酸(PBAQA). 二胺化合物经二碳酸二叔丁酯单保护、酰胺缩合、盐酸脱保护基，再与另一端苯基硼酸化合物酰胺缩合，合成了3个含有PBAQA结构的二硼酸新化合物，考察了溶剂选择、反应温度、活化反应时间以及反应中羧基化合物与1,3-二环己基碳化二亚胺(DCC)和1-羟基苯并三唑(HOBT)物质的量之比对二硼酸类化合物收率的影响. 通过IR、1H NMR、13C NMR、HRMS对新化合物的结构进行表征. 结果表明最佳反应条件为以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作溶剂，反应温度20 ℃，活化反应60 min，反应中羧基化合物与DCC和HOBT的物质的量之比在1∶20∶20的条件下，收率可达82%，纯度90%. 该合成路线具有操作步骤简便，经济适用，副产物少易于纯化等特点，对二硼酸化合物衍生化研究具有重要实用和经济价值.

硼酸类化合物;儿茶酚;荧光探针;合成

儿茶酚物质在体内分布广泛且发挥多种生物活性，特别是儿茶酚胺类物质(如多巴胺，左旋多巴，肾上腺素等)[1-4]对体内心血管疾病和中枢神经系统疾病产生重要影响[5-7]. 因此开发选择性识别儿茶酚胺类物质的荧光探针具有重要实用和科学意义. 荧光传感器具有非侵入性，不会破坏目标化合物结构，可用于活体组织内化合物的检测[8-9]. 荧光信号传输快，具有高灵敏度的特点，可用于化合物的实时监测. 2-(4-二羟基硼烷)苯基喹啉-4-羧酸(PBAQA)是一个针对儿茶酚胺类和糖类化合物具有选择性的有机硼酸类荧光探针[10]. 该化合物与糖类化合物结合后荧光强度显著增高，例如PBAQA与25 mmol/L果糖相互作用后，荧光强度提高25倍，但与儿茶酚胺类化合物结合后荧光响度显著下降，例如PBAQA与1.0 mmol/L儿茶酚结合后，荧光强度下降60%，从而可作为对儿茶酚的选择性荧光探针[11]. 目前基于PBAQA的二硼酸类化合物被开发用于新药开发[12]以及用于开发识别氟离子、过氧化氢、儿茶酚胺类[11]等物质的荧光的探针.

通过对以PBAQA为母核化合物的衍生化研究，科学家发现二硼酸化合物1(如图1)与1 mmol/L浓度的多巴胺结合后荧光强度下降约30%，且荧光强度下降呈现多巴胺依赖性[13]. 初步荧光结合实验结果表明，该化合物对多巴胺的结合常数明显高于PBAQA化合物与儿茶酚和L-DOPA的结合常数. 含有三氮唑的二硼酸化合物2 (如图1)对寡糖具有较好的选择性[14]. 用10 μmol/L化合物2的磷酸盐缓冲液进行结合活性测试表明，0.025 μmol/L浓度的唾液酸化Lewis A 可引起荧光强度增加31%；0.025 μmol/L浓度的唾液酸化Lewis B 可引起荧光强度增加19%. 实验说明基于PBAQA构建单元(Building Block)的二硼酸化合物对肿瘤细胞表面特异性寡糖唾液酸化Lewis A和唾液酸化Lewis X表现出明显选择性，可用于肿瘤诊断试剂的开发.

图1 二硼酸化合物1和二硼酸化合物2的分子结构式Fig.1 Structure formula of bisboronic acid 1 and bisboronic acid 2

基于2-(4-二羟基硼烷)苯基喹啉-4-羧酸的二硼酸化合物合成一般有两种路线，方法一：先利用溴代物进行衍生化，最后通过钯催化交叉偶联反应制备. 但钯催化反应需要长时间高温操作，容易导致硼酸基团降解. 最后二溴代物转变为二硼酸，该步反应硼酸化不完全，易产生单硼酸副产物，且由于该类化合物属于水溶性荧光探针，极性较大，分离纯化损失较多. 方法二：先制备单硼酸中间体，再利用酰胺缩合反应制备二硼酸化合物，酰胺缩合反应是采用SOCl2活化羧基，形成活性高的酰氯，在低温下逐滴加入氨基化合物的溶液. 该方法操作复杂，副产物多，分离和提纯难度大. 本文通过改进方法二，设计出一条简单高效的合成路线，即首先利用二碳酸二叔丁酯单保护二胺化合物，然后与使用SOCl2活化的羧基酰胺缩合，通过盐酸脱去BOC基团，形成盐酸盐沉淀析出，收率95%，纯度98%，将生成的盐酸盐中间体可直接参与第二步酰胺缩合反应. 第二步酰胺缩合反应使用碳二亚胺类缩合剂法，将羧基苯硼酸化合物溶于DMF中，利用DCC和HOBT活化羧基，然后与上一步的PBAQA衍生物酰胺缩合，收率82%，纯度90%. 相比酰氯法，该步避免了SOCl2的使用，减少刺鼻气体和废液的产生，绿色环保而且操作简便高效. 采用控制变量的方法研究了溶剂选择、反应温度、DCC和HOBT活化时间、羧基化合物与DCC和HOBT反应的物质的量之比对目标化合物收率的影响. 合成路线如图2.

图2 化合物14a，14b，14c的合成Fig.2 Synthesis of compounds 14a, 14b and 14c

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

DF101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器、低温恒温搅拌反应浴(郑州长城科工贸有限公司)； Waters2695 型高效液相色谱仪(美国Waters 公司)；U-3000 紫外-可见光分光光度计(日本日立(Hitachi))；Nexus 670型傅立叶红外光谱仪(美国尼高力仪器公司(Thermo-Nicolet))；德国Bruker AM-600德国核磁共振仪；4-溴苯乙酮、靛红、Pd-catalyst、Bis(pinacolato)diboron、KOAc、二碳酸二叔丁酯、丙二胺、丁二胺、4-羧基苯硼酸、2-氯-4-羧基苯硼酸等购于阿拉丁公司，其他所有试剂均为分析纯以上.

1.2 方法

1.2.1 2-(4-溴苯基)喹啉-4-羧酸的合成(5)[15]

向反应瓶加入12 g (0.06 mol) 4-溴苯乙酮、7.5 g (0.05 mol)靛红、30 mL 33% 的KOH溶液、70 mL乙醇，室温搅拌8 h，HPLC检测反应进程，反应结束减压除去溶剂，用盐酸调节pH=3，析出棕红色沉淀. 水洗，乙酸乙酯洗，甲醇-冰醋酸重结晶，得浅棕色化合物5，收率70%. 熔点240～241 ℃ (lit. 239～240 ℃). ESI-MS:m/z329.7[M+1]+.

1.2.2 2-(4-溴苯基)喹啉-4-甲酸甲酯的合成(6)

向圆底烧瓶中加入12.0 g (32.40 mmol)化合物5、40 mL SOCl2、一滴DMF，搅拌回流4 h，HPLC检测反应进程. 反应结束减压除去溶剂，得黄色粉末状固体. 将黄色粉末状固体溶于二氯甲烷中，冰浴下滴入含有5 mL三乙胺的甲醇中. 滴毕，HPLC检测反应进程. 反应结束减压除去溶剂，深黄色固体粉末经重结晶，得浅黄色固体6，收率64%. ESI-MS:m/z342, 344[M+1]+.

1.2.3 2-(4-二羟基硼烷)苯基喹啉-4-甲酸甲酯的合成(7)

向反应瓶中加入6.0 g (17.54 mmol)化合物6、0.60 g (0.11 mol)醋酸钾、3.16 g (52.62 mmol) Bis(pinacolato) diboron、0.34 g (1.75 mmol) Pd(dppf)Cl2、50 mL DMSO，加氮气保护，80 ℃下搅拌12 h，HPLC检测反应进程. 反应结束后将溶液倒入100 mL冰水，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗. 减压除去溶剂后溶于THF/H2O(4∶1, 50 mL)，加1.31 g (0.11 mol)高碘酸钠，室温搅拌溶解后加入10 mL稀盐酸(2 mol/L)，继续室温搅拌过夜. 反应结束，过滤，乙酸乙酯洗涤，滤液混合后加50 mL冰水，用乙酸乙酯萃取. 有机相经饱和食盐水水洗，干燥得棕黄色固体7.

1.2.4 2-(4-二羟基硼烷)苯基喹啉-4-羧酸的合成(8)

将上一步所得的化合物7溶于100 mL无水甲醇，冰浴下加入40 mL氢氧化钠(2 mol/L)溶液中，搅拌至全部水解，将溶液减压浓缩后用盐酸(2 mol/L)调节pH至弱酸性，析出棕黄色沉淀8，经甲醇重结晶得土黄色固体粉末8，两步合并收率32%. ESI-MS:m/z294 [M+1]+.1H NMR (600 MHz, DMSO)δ8.67 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 8.52 (d,J= 12.7 Hz, 1H), 8.29 (d,J= 7.9 Hz, 2H), 8.23 (d,J= 8.3 Hz, 1H), 8.02 (d,J= 7.8 Hz, 2H), 7.89 (t,J= 7.5 Hz, 1H), 7.74 (t,J= 7.6 Hz, 1H).

1.2.5 N-Boc-丙二胺的合成(11)

向圆底烧瓶中加入3.71 g (0.05 mol)丙二胺、100 mL甲醇、10 mL三乙胺. 将3.63 g (0.017 mol)二碳酸二叔丁酯9溶于20 mL甲醇中，在剧烈搅拌下逐滴加入反应液中(半小时内滴加完毕)，室温搅拌过夜. HPLC检测反应进程，反应完毕减压除去溶剂，溶于100 mL二氯甲烷中，用10%碳酸钠溶液萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得黄色油状物(浑浊状). 粗品经硅胶柱层析纯化，得浅黄色油状物11，收率28%.

1.2.6 化合物12的合成

向圆底烧瓶中加入1 g (3.41 mmol)化合物8、30 mL SOCl2、一滴DMF，加热回流4 h. HPLC检测反应进程，反应完毕，减压除去溶剂得黄色粉末状固体，溶于二氯甲烷. 在冰浴环境下滴入溶有1.2 g (4.09 mmol)N-Boc-丙二胺、1.23 g (12.28 mmol)三乙胺的二氯甲烷反应液中，常温搅拌12 h，减压除去溶剂，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水水洗，合并有机相，加3 mL盐酸溶液，常温搅拌3 h，HPLC检测反应进程，反应结束过滤，乙酸乙酯洗涤，得黄色固体化合物12，收率95%，纯度98%.

1.2.7 化合物14a的合成

向250 mL圆底烧瓶中加入羧基苯硼酸13、DCC、HOBT、TEA和100 mL DMF, 20 ℃温度下活化1 h，加入化合物12搅拌8 h，HPLC检测反应进程，反应完毕，70 ℃真空旋蒸除去溶剂，加入饱和氯化钠水溶液(200 mL)，用乙酸乙酯萃取，重复4次，合并有机相，减压除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，得到目标化合物14a，收率76%. MS (m/z): 498.2 [M+1]+.1H NMR (600 MHz, MeOD)δ8.18 (dd,J= 25.3, 8.4 Hz, 4H), 8.08 (s, 1H), 7.94 (d,J= 6.4 Hz, 1H), 7.83～7.78 (m, 5H), 7.68 (s, 1H), 7.63 (t,J= 7.5 Hz, 1H), 3.60 (t,J= 6.5 Hz, 2H), 3.56 (t,J= 6.6 Hz, 2H), 2.01 (t,J= 6.6 Hz, 2H). HRMS: C26H26O6N3B2,m/z:calculated 489.200 4, found 489.200 2.

化合物14b，收率74%. MS (m/z):532.1 [M+1]+.1H NMR (600 MHz, MeOD)δ8.20 (d,J= 8.3 Hz, 2H), 8.15 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 8.09 (s, 1H), 7.94 (d,J= 6.7 Hz, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.80 (t,J= 7.6 Hz, 2H), 7.75 (d,J= 7.5 Hz, 1H), 7.63 (dd,J= 8.0, 7.2 Hz, 1H), 7.42 (d,J= 7.4 Hz, 1H), 3.59 (t,J= 6.7 Hz, 2H), 3.55 (t,J= 6.7 Hz, 2H), 2.01 (t,J= 6.7 Hz, 2H).

化合物14c，收率77%. MS (m/z): 546.1 [M+1]+.1H NMR (600 MHz, MeOD)δ8.15 (dt,J= 11.2, 6.2 Hz, 4H), 8.03 (s, 1H), 7.92 (t,J= 14.8 Hz, 1H), 7.85～7.77 (m, 4H), 7.73 (d,J= 7.4 Hz, 1H), 7.60 (t,J= 8.1, 7.2 Hz, 1H), 7.42 (d,J= 7.5 Hz, 1H), 3.55 (s, 2H), 3.46 (s, 2H), 1.79 (s, 4H).

2 结果与讨论

2.1 二硼酸目标化合物(14)的合成

2.1.1 溶剂的选择

本文考察了在羧基苯硼酸与DCC、HOBT物质的量之比为1∶20∶20，反应温度20 ℃，反应时间8 h的条件下，二氯甲烷、四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺作溶剂对收率的影响，如表1所示. 结果表明，选择强溶解性和大极性的DMF做溶剂，收率可达82%. 化合物12在二氯甲烷、四氢呋喃等较低极性溶剂溶解性较差，导致收率较低.

表1 溶剂对收率的影响

2.1.2 温度的选择

在羧基苯硼酸与DCC、HOBT物质的量之比为1∶20∶20，反应温度20 ℃，反应时间6 h 后，考察了温度对收率的影响，如表2所示. 实验说明温度过低不利于反应的进行，随着温度反应升高，反应收率增加，同时，温度升高副产物增加，纯度降低，因此最佳的反应温度为20 ℃.

表2 温度对收率的影响

2.1.3 活化时间的选择

以DMF作为溶剂，反应中-COOH∶DCC∶HOBT的物质的量的之比为1∶20∶20，反应温度20 ℃的条件下，活化时间增加，收率增大，如表3所示. DCC为碳二亚胺类的缩合剂，使用该缩合剂一般需要加入酰化催化剂HOBT，主要是因为反应的第一阶段所生成的中间体不稳定，若不用酰化催化剂转化为相应的活性酯，其自身易形成脲. 其次，羧基直接连在苯环上，由于空间位阻等原因使这类缩合剂的活性变弱，在弱酸性条件下活性较好，反应一段时间后加入化合物12以及一定量的三乙胺，活化反应 60 min以上收率保持不变，因此最佳活化反应时间为60 min.

表3 活化反应时间对收率的影响

2.1.4 羧基化合物与DCC和HOBT物质的量的之比的选择

以DMF作为反应溶剂，加入DCC、HOBT活化60 min，加入化合物12搅拌反应8 h，考察羧基化合物与DCC和HOBT不同摩尔比对产物收率的影响，如表4所示. 结果表明羧基化合物与DCC和HOBT反应中物质的量之比为1∶20∶20下，收率可达82%，纯度90%. 一般酰胺缩合反应中DCC和HOBT的投料在1到2当量之间，但试验发现产率极低，可能是羧基连在苯环上，由于空间位阻等原因使活化剂活性变弱，通过增大DCC和HOBT的比例，使反应向形成活性酯方向移动，从而参与到与氨基化合物的羧基反应中. 实验表明，羧基化合物与DCC和HOBT物质的量的投料之比为1∶20∶20时，收率最高.

表4 羧基化合物与DCC和HOBT物质的量之比对产率的影响

an(-COOH)∶n(DCC)∶n(HOBT).

3 结论

1)本文以实验室廉价易得的原料和试剂，开发出一条二硼酸化合物制备新方法. 二胺类化合物廉价易得，选择不同长度的二胺类化后作为Linker，简单高效的修饰两个硼酸之间的刚性结构与距离. 第一步酰胺缩合利用了酰氯活性高的特点，通过盐酸法脱BOC基团形成盐酸盐沉淀，该方法操作简单收率高，收率95%，纯度98%，纯度满足下一步反应的要求. 因酰氯活性高，副产物多，难于分离纯化，故第二步酰胺反应选择使用DCC和HOBT作为缩合剂，避免了酰氯法复杂的操作以及刺鼻气体和废液的产生，为一条绿色环保的方法. 最佳反应条件为以DMF作溶剂，反应温度20 ℃，活化反应60 min，羧基化合物与DCC和HOBT反应的物质的量之比为1∶20∶20的条件下，收率可达82%，纯度90%.

(2)通过IR、1H NMR、13C NMR、 HRMS对新化合物的结构进行表征. 化合物14a、14b、14c、及中间体12均为新化合物. 鉴于苯基硼酸类化合物结构中引入吸电子基团，可降低硼酸化合物pKa，改善与糖及儿茶酚胺类物质的结合常数[9]，故选择在二硼酸结构中引入吸电子基团(如14b、14c引入吸电性氯原子)，对寻找针对儿茶酚胺的新型水溶性荧光探针具有重要意义. 该合成路线具有操作步骤简便，经济适用，副产物少且易于提取分离等特点，非常适合实验室二硼酸衍生化和以及用于开展药物开发与荧光探针发向的课题研究.

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[责任编辑：刘红玲]

Synthesis of bisboronic acid derivatives base on 2-(4-boronophenyl)quinoline-4-carboxylic acid

WANG Kai, ZHANG Haochao, SUN Jingyong, YAO Qingqiang*, WU Zhongyu*

(1.SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250200,Shandong,China; 2.InstituteofMateriaMedica,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,Shandong,China; 3.KeyLaboratoryforBiotech-DrugsMinistryofHealth,Jinan250062,Shandong,China; 4.KeyLaboratoryforRare&UncommonDiseasesofShandongProvince,Jinan250062,Shandong,China)

2-(4-boronophenyl)quinoline-4-carboxylic acid (PBAQA) was synthesized by the Pfitzinger reaction, carboxyl esterification, Pd-catalyzed reaction and hydrolysis reaction, using 1-(4-bromophenyl)ethanone and isatin as the major starting materials. Three PBAQA bisboronic acid compounds were synthesized through monoprotection of the diamine compounds by tert-butyl ester carbonate, amide condensation reaction, deprotection by hydrochloric acid and amide condensation with another phenyl boronic acid. The effect of solvent, reaction temperature, mole ratio of carboxyl compound, N, N’-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and NHydroxybenzotrizole (HOBT), the activation time on the yield of bisboronic acid compounds were investigated. All novel compounds were characterized by IR, NMR, HRMS, etc. The optimized experimental conditions were as follows: 20 ℃ of reaction temperature 60 minubes of reaction time and 1/20 of mole ratio of carboxyl compound, DCC and HOBT in the solvent of N, N’-dimethyl formamide (DMF). Under the optimized conditions, the yield of bisboronic acid compounds was up to 82% and the purity was 90%. This synthetic route has many advantages, such as low cost, less by-products, easy purification and high yields.

boronic acid compounds; catechol; fluorescent sensor; synthesis

2016-12-22.

山东省自然科学基金资助项目(ZR2014YL035)，2014年度留学人员科技活动项目择优资助项目，济南大学教研项目(J1447)，山东省医学科学院医药卫生科技创新工程.

王 凯(1989-),男,硕士生,研究方向为药物化学.*

, E-mail：yao_imm@163.com.

O627

A

1008-1011(2017)02-0185-06