硫氧化菌的地域分布特征

张爽，晏磊，陈志宝

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

硫氧化菌的地域分布特征

张爽，晏磊，陈志宝

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

通过对NCBI数据库中硫氧化菌的现有16S rDNA序列分析，并构建硫氧化菌系统进化树，进而探讨不同地域硫氧化菌分布特性。NCBI中共有硫氧化菌16S rDNA序列298条，经相似性分析后发现共有53条不同的序列，分别源自温泉湖、矿区、泻湖等区域。全长序列的系统进化分析显示，全球硫氧化菌的分布具有一定的地域性，即温泉湖与矿区、泻湖的硫氧化菌差别明显。不同地域硫氧化菌的系统进化分析显示，铅锌矿区与铜矿区的硫氧化菌区分明显；而同为温泉湖或矿区、泻湖生境中的硫氧化菌相似性极高，即相同生境中的硫氧化菌相似性较高，表明硫氧化菌的类型与生境条件有较大的关联性。基于对硫氧化菌16S rDNA的序列分析，推测硫氧化菌的起源可能是多源的，生境条件作为重要的进化压力在硫氧化菌长期演化过程中具有举足轻重的作用。

硫氧化菌；16S rDNA序列分析；系统发育；地域分布

硫氧化菌（Sulfur oxidizing bacteria，SOB）是一类通过氧化还原性硫化物获取能源生长的特殊微生物，在pH 1.0～9.0的环境中均能生长[1]。SOB在自然界的分布极为广泛，从火山熔岩到矿山废水[2]，从海洋底泥到盐碱湖泊[3]，从陆地热泉到油藏卤水[4-5]，从根际土壤到地表河流[6]，即使在金属离子浓度极高的区域[7]，都分布了SOB的一些种类，是极端环境中占优势的古老微生物之一。由于SOB在硫的地球化学循环中的重要作用，以及在生物浸矿和环境治理方面的应用，使其成为当前地球科学、环境科学以及生物科学等领域的研究热点。

目前为止，从NCBI信息库中搜索到的硫氧化菌序列共298条，但由于硫氧化菌在培养过程中对营养及氧的要求比较苛刻，实验室环境难以重现其真实生存环境，因此获得的纯培养硫氧化菌种类较少。16S rDNA在结构与功能上具有极高的保守性，因此常被用作原核生物系统发育以及多样性研究的标志性基因，用表型方法难以鉴定的细菌，用16S rDNA序列分析均能进行准确的鉴定[8]。由于目前获得的硫氧化菌纯培养菌株种类较少，使得多数未纯培养的硫氧化菌通过分析16S rDNA序列来确定它们的系统进化位置。近年来，由于硫氧化菌在分子形态、生理活性以及系统发育等方面具有多样性，硫氧化菌的生态学意义被广泛关注。研究旨在通过对来自NCBI中298条不同地域和生境及相同地域和生境的硫氧化菌16S rDNA序列进行的分析，及对温泉湖、矿区、泻湖等已发现的硫氧化菌系统进化树的构建，初步探讨硫氧化菌的地域分布特征。

1 数据来源与分析方法

1.1 数据来源

研究所使用的数据均来自截至2014年3月在NCBI信息库中搜索，获得硫氧化菌298条16S rDNA。搜索关键词包括Sulfobacillus acidophilus，Sulfobacillus thermotolerans，Sulfolobus tokodaii等，尽可能涵盖所有硫氧化菌16S rDNA序列，并对获得的硫氧化菌16S rDNA序列进行必要的筛选，删除非硫氧化菌的16S rDNA序列。

1.2 数据整理与分析方法

将筛选后的硫氧化菌 16S rDNA序列进行BLAST比对（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov／blast），每条序列即可获得与其相似性最高的序列，再利用clustal1.83软件对得到的硫氧化菌16S rDNA序列进行相似性分析。Stackebrandt等[9]认为，当16S rDNA相似性高于97%以上时，即可判定为同属于一个种。如若同一个地点、同一次提交的序列中有2条序列的相似性均高于97%，即可判定两者为同一种硫氧化菌的序列，则保留其中一个序列即可。将所有序列逐一整理，按生境（火山熔岩、矿山废水、海洋底泥、盐碱湖泊、陆地热泉、油藏卤水、根际土壤、地表河流湖泊和矿区等）、分类地位、发现地域和所属国家、以及序列长度等方面进行归类并逐一统计。

由于所提交的16S rDNA序列存在长度不等问题，无法直接构建其系统进化树。因此，研究利用硫氧化菌16S rDNA序列的前段（约750 bp）、中段（约600 bp）及后段（约750 bp）分别进行系统进化树分析，并从中挑选全长序列进行系统进化分析。充分应用MEGA5.0软件利用N-J法构建系统进化树，从而实现硫氧化菌的系统进化分析。同时，对不同生境（湖泊和矿区火山熔岩、矿山废水、海洋底泥、盐碱湖泊、陆地热泉、油藏卤水、根际土壤、地表河流湖泊和矿区等）的硫氧化菌进行分析，对不同地域的硫氧化菌进行分析，探索其规律性。

2 结果与分析

2.1 原始数据整理

从NCBI信息库中共搜索到硫氧化菌16S rDNA序列298条，其中包括湖泊硫氧化菌序列185条，矿区硫氧化菌序列115条。利用clustal1.83软件对获得的硫氧化菌16S rDNA序列进行相似性分析，若相似性高于97%即判定为属于同一序列[9]；若有2条序列相似性均高于97%，则保留其中一个序列即可。删除重复序列后所获得的湖泊、矿区硫氧化菌序列分别为36条、17条，共计53条，见表1。

表1 硫氧化菌种数统计（据提交NCBI的16S rDNA序列数统计）Table 1 Sulfur oxidizing bacteria statistics（according to the 16S rDNA submitted to the NCBI）

在获得的53条不同硫氧化菌序列中，γ-变形菌纲序列15条，热变形菌纲序列14条，绿菌纲序列13条，绿弯菌纲和β-变形菌纲的硫氧化菌序列较少。

研究发现，硫氧化菌的发现地点主要集中在中国、印度、智利、伊朗等。各地发现的硫氧化菌均以热变形菌纲居多，而中国发现的以梭状芽孢杆菌纲居多。

2.2 硫氧化菌系统进化分析

研究筛选后的16S rDNA序列共53条，因获得的16S rDNA序列长度不等，无法直接构建其系统进化树。故分别选取硫氧化菌16S rDNA序列的前段（约750 bp）、中段（约600 bp）及后段（约750 bp），构建较为精确的系统进化树，并进行比较分析（图1）。从系统进化树中不难发现湖泊（温泉湖、泻湖）硫氧化菌与矿区硫氧化菌聚类分区明显，各自分区聚类在一起，但是由于所属纲不同，硫氧化菌的分布有所不同。

2.3 不同区域的硫氧化菌比较

2.3.1 湖泊与矿区硫氧化菌比较

湖泊与矿区硫氧化菌的比较（见图1），由图1可见，湖泊中以热变形菌纲和绿菌纲硫氧化菌为主，约为75.0%；而矿区中的硫氧化菌以γ-变形菌纲为主，约为88.2%。同时，由图1的进化树也可以发现，湖泊与矿区硫氧化菌相似程度较低，表明系统进化位置具有明显差别。

图1 湖泊与矿区中硫氧化菌系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of SOB in lake and mine

2.3.2 温泉湖与泻湖硫氧化菌比较

温泉湖（中国厦门海）与泻湖中硫氧化菌的比较（见图2），由图2可见，泻湖中发现的硫氧化菌以绿菌纲为主，相较于温泉湖中发现的热变形菌纲和梭状芽孢纲，其同源性约为78%，表明温泉湖中的硫氧化菌与泻湖中的硫氧化菌相似程度较低。温泉湖中的硫氧化菌具有嗜热嗜酸的特性，而泻湖中发现的硫氧化菌通常能够耐受较高浓度，推测温泉湖与泻湖硫氧化菌区分明显可能是其自身特性不同产生的结果。

图2 温泉湖与泻湖中发现的硫氧化菌系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of SOB in hot spring and lagoon

2.3.3 不同地域矿区硫氧化菌比较

不同地域矿区硫氧化菌的比较，仅针对中国与智利、秘鲁矿区生境硫氧化菌进行比较（见图3），由图3可见，在智利与秘鲁矿区中发现的硫氧化菌属于梭状芽孢杆菌纲，而中国矿区发现的硫氧化菌多属于γ-变形菌纲。因不同地域矿区硫氧化菌所属分类地位不同，使得硫氧化菌的相似性极低，各自形成独立分支。伴随着研究的不断深入，不同地域硫氧化菌的多样性特性将不断明晰。

图3 中国与智利发现的矿区中硫氧化菌系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of SOB in mine from China and Chile

3 讨论

通过对不同地域硫氧化菌系统进化的分析，不难发现相近生境的硫氧化菌相似性较高。此外，目前发现的硫氧化菌多存在于湖泊，并以温泉湖为主，且多为温泉湖出口。由此推测硫氧化菌的分布可能具有区域性特征，其在世界各地的生境中可能以“土著”的方式存在。为了适应生境，不同地域类型硫氧化菌经过长期进化被逐渐形成。

对比矿区与湖泊硫氧化菌，不难发现温泉湖硫氧化菌16S rDNA序列大多聚集在一起，与矿区或泻湖中发现的硫氧化菌形成明显分支差异。存在于相似生境的硫氧化菌相似性程度较高，究其原因可能是由于相似生境具有相似条件（如温度、酸度、盐度及其他种类元素等），而生境又是推动硫氧化菌进化的主动力，因此促使硫氧化菌向同一方向进化，最终形成相似性较高的硫氧化菌。反之，不同生境的硫氧菌经长期进化形成不同类型的硫氧化菌。

纵使相似生境中发现的硫氧化菌相似性较高，但也存在特例。研究发现矿石浸出物中的硫氧化菌（EF101930.1）与在温泉湖发现的硫氧化菌（EU419196.1），经软件分析发现两者相似性高达92%。换言之，在不同地域生境中发现了2株16S rDNA序列比较接近的硫氧化菌。可能是由于原本独立存在的硫氧化菌在进化过程中被趋同进化，进而形成相似性极高的硫氧化菌类型。这2株相似性极高的硫氧化菌可能是进化过程的偶然现象，也有可能是生境被作为进化压力的某些环境因子（如温度、酸度、盐度及其他种类元素等）发挥了作用，导致硫氧化菌朝同一方向进化。仅通过数据分析并不能完全认定这2株相似性较高的硫氧化菌为功能相同的一类原核微生物。据张文燕等[8，10]报道，引起痢疾的病原菌与普通大肠杆菌的16S rDNA相似性高于97%，系统进化分析认为二者属于同一类细菌，但实则二者生理功能不同，且功能迥异。因此，鉴于具有特定功能的一类原核微生物而言，如硫氧化菌，功能基因或全基因组的分类分析较16S rDNA构建的系统进化树意义更为深远。

研究受NCBI数据库硫氧化菌16S rDNA序列数量的限制，故有些分析结果还需更深入的研究来证实。伴随着硫氧化菌研究的不断深入及微生物分离及培养技术的不断完善，更多、更纯的硫氧化菌将被获得。同时，随着种类繁多、数量庞大的硫氧化菌的不断发现，辅以分子和基因水平的深入研究，必将获得不同地域有关于硫氧化菌更多、更全的生态信息，为更深入的认识和理解硫氧化菌生境意义和应用前景打下更为殷实的基础。

4 结论

利用NCBI数据库分析硫氧化菌16S rDNA序列，系统进化分析发现处于不同地域的硫氧化菌具有明显的地域分布特性，如湖泊（温泉湖、泻湖）与矿区之间的硫氧化菌区分明显。而处于相同生境的硫氧化菌，如同处于湖泊（温泉湖、泻湖）或矿区，则相似性极高，充分说明硫氧化菌类型与生境之间具有密切联系。这些发现均验证生境作为进化压力在硫氧化菌长期进化过程中决定其向同一方向进化（相似环生境形成相似硫氧化菌类型）或多元化方向进化（不同生境形成不同硫氧化菌类型），由此推测硫氧化菌的起源可能是多源的。

［1］ Biderre-Petit C，Boucher D，Kuever J，et al.Identification of sulfur-cycle prokaryotes in a low-sulfate lake（Lake Pavin）using aprA and 16S rRNA gene markers［J］.Microbial Ecology，2010，61（2）：313-327.

［2］ Ghosh W，Dam B.Biochemistry and molecular biology of lithotrophic sulfur oxidation by taxonomically and ecologically diverse bacteria and archaea［J］.FEMS Microbiology Reviews，2009，33（6）：999-1043.

［3］ Jung M Y，Pham V H，Park S J，et al.Metagenomic assessment of a sulfur-oxidizing enrichment culture derived from marine sediment［J］.The Journal of Microbiology，2010，48（6）：739-747.

［4］ Wei L，Ma F，Zhao G.Composition and dynamics of sulfate-reducing bacteria during the waterflooding process in the oil field application［J］.Bioresource Technology，2010，101（8）：2643-2650.

［5］ Ogg C D，Patel B K C.Desulfotomaculum varum sp.nov.，a moderately thermophilic sulfate-reducing bacterium isolated from a microbial mat colonizing a Great Artesian Basin bore well runoff channel.3［J］.Biotech，2011（3）：139-149.

［6］ Liu X Z，Zhang L M，Prosser J I，et al.Abundance and community structure of sulfate reducing prokaryotes in a paddy soil of southern China under different fertilization regimes［J］.Soil Biology and Biochemistry，2009，41（4）：687-694.

［7］ Ghosh W，Dam B.Biochemistry and molecular biology of lithotrophic sulfur oxidation by taxonomically and ecologically diverse bacteria and archaea［J］.FEMS Microbiology Reviews，2009，33（6）：999-1043.

［8］ 张文燕，张圣妲，肖天，等.趋磁细菌的地域分布特性［J］.环境科学，2010，31（2）：450-458.

［9］ 石艳玲，郑伟.景观水体微生态调控试验研究——以日照职业技术学院乐学河生态修复为例［J］.长春大学学报，2014，24（4）：468-472.

［10］ 王长虹，王国兴，晏磊，等.寒区条垛式和槽式堆肥工艺的比较研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2016，28（1）：68-72.

Geographical Distribution of Sulfur-oxidizing Bacteria

Zhang Shuang，Yan Lei，Chen Zhibao
（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Sulfur-oxidizing bacteria（SOB）were widely distributed in aquatic environments.To investigate the correlation between their evolutionary relatedness and geographical distribution，298 16S rDNA sequence available in the NCBI were analyzed，and phylogenic trees based on the sequences were constructed.Total 53 16S rDNA sequences of SOB were analyzed in detail，which derived from hot spring，mine and lagoon.Phylogeny analysis based on those sequences suggested that the geographical distribution of SOB had certain regional distribution character：SOB was different from hot spring，mine and lagoon.Regional analysis based on phylogenic analysis also suggested that the difference from lead-zinc mine and copper mine.In contrast，the SOB from similar habitats were closely related，such as hot spring，mine and lagoon.It was found that similar species had a large regional distribution and tried to adopt the similar habitats，morphotypes of SOB and their living conditions had a significant relevance.The observation suggested that SOB might have multiple evolutionary origins.And it also suggested that the environmental conditions，as an important evolutionary pressure，played an important role in the long-term evolution of SOB.

Sulfur oxidizing bacteria（SOB）；16S rDNA sequence analysis；phylogeny analysis；geographical distribution

Q938

A

1002-2090（2017）02-0068-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.014

2016-03-29

张爽（1981-），女，讲师，黑龙江八一农垦大学毕业，现主要从事微生物药物分析方面的教学与研究工作。