金银花常用农药对其绿原酸含量影响的初步研究

李嘉欣，薛健*，金红宇，马双成

(1.中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050)

金银花常用农药对其绿原酸含量影响的初步研究

李嘉欣1，薛健1*，金红宇2，马双成2

(1.中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050)

目的：研究防治金银花病虫害常用农药吡虫啉、啶虫脒、三唑酮对金银花中绿原酸含量的影响，为三种农药的合理使用提供参考。方法：采用田间试验的方法，喷施不同浓度的三种药剂(吡虫啉30 g/hm2、90 g/hm2；啶虫脒3.75 g/hm2、18.75 g/hm2；三唑酮114 g/hm2、342 g/hm2)，于施药后2 h、1、2、3、5、6、7、9、10、12 d分别采集金银花样品，使用药典方法测定样品中绿原酸含量，对结果进行统计学分析。结果：喷施不同浓度吡虫啉与啶虫脒的金银花样品与空白组样品相比，绿原酸含量增加，而喷施不同浓度三唑酮的金银花样品绿原酸含量则降低，各施药组测得绿原酸含量均符合药典要求。三种农药对绿原酸含量的影响程度均随施药剂量的增加而增加，除啶虫脒低剂量组对绿原酸含量无显著影响外，其他施药组均有极显著影响。结论：吡虫啉、啶虫脒促进金银花中绿原酸的积累，三唑酮则抑制绿原酸的积累，使用时应有所注意。

金银花；吡虫啉；啶虫脒；三唑酮；绿原酸

药用植物作为一类生长特殊、成分复杂的特色小宗植物，在其栽培过程中常使用化学技术，尤其是农药来防治病虫害。由于药用植物的药理作用与质量取决于其所含有效成分的类别与积累量，因此不同于其它作物，在药用植物的种植过程中更应关注其所含的有效成分。任斌等[1]研究发现，喷施不同浓度吡虫啉防治枸杞蚜虫病时，枸杞果实中黄酮含量明显升高，对枸杞类胡萝卜素含量也有不同程度的影响。刘洪科[2]用多菌灵、代森锰锌、世高处理龙胆褐斑病和斑枯病时发现，供试农药对龙胆苦苷含量有所影响但并不明显。沈一行等[3]发现，喷施杀菌剂敌克松后，曼陀罗及毛曼陀罗的花和叶中所含生物碱的含量均显著下降。由此可见，农药的施用会对药用植物的有效成分造成一定的影响。然而现阶段，对于农药在药用植物上的研究，大多集中在农药对病虫害的防治效果、农药残留方面，农药对药用植物中有效成分影响的研究才刚刚起步[4-8]。

金银花作为中国传统的药食两用中药材之一，有着悠久的用药历史，其市场需求量庞大。河南省封丘县为金银花的主要产区之一，在对当地金银花种植情况调研后发现，当地金银花在生产过程中病虫害干扰严重，其中虫害以蚜虫为主，病害以白粉病为主。由于金银花中尚无登记农药，所以当地农户常根据农药销售店的推荐或种植经验，选择吡虫啉、啶虫脒防治蚜虫病，三唑酮防治白粉病。绿原酸作为金银花的主要药用成分与次生代谢产物，是衡量金银花质量的指标成分之一[9-10]。然而对于金银花品质的评价，主要集中在对不同采收期绿原酸含量的分析，农药的种类、施用剂量等因素是否对金银花中绿原酸产生影响却鲜有报道，所以有必要对农药在金银花生长过程中对其药用成分的影响进行研究[11-13]。本研究采用田间试验的方法对以上三种常用农药进行研究，对农药在不同喷施剂量下金银花中绿原酸的含量进行了测定，以考察不同农药与剂量对金银花中绿原酸的影响，旨在为金银花中农药的合理、安全、规范使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

试剂：甲醇(分析纯，北京化工厂)；磷酸(分析纯，天津市光复化工试剂厂)；乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；水(MiLLi-Q超纯水)；绿原酸(中国食品药品检定研究院)。

供试药剂：吡虫啉(10%可湿性粉剂，江苏省吴县市农药厂)；啶虫脒(3%乳油，日本曹大株式会社)；三唑酮(20%乳油，江苏建农农药化工厂有限公司)。

仪器：高效液相色谱(Waters 2695)，配紫外检测器；色谱柱Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent)；电子分析天平(PL203型，梅特勒-托利多仪器有限公司)；超声波清洗机(T-310型，北京天鹏有限公司)。

1.2 田间试验及样品采集

田间试验在河南省新乡市封丘县进行。参照农业部制定的《农药残留试验准则》[14](NY/T 788-2004)，使用吡虫啉、啶虫脒、三唑酮进行金银花绿原酸含量试验。每种农药设低剂量、高剂量2个处理，每个处理设3个重复，另设1个空白对照组，共19个小区，每个小区种植面积为10 m2，种植金银花13株，小区间设1行保护行，行距1 m。以《农药合理使用准则》[15]所规定的每次施用剂量或稀释倍数为参考，考虑到农民在种植过程中可能要多次喷施且剂量高于农药说明书用量，故本实验三种农药的具体用量为：吡虫啉低剂量30 g/hm2，高剂量90 g/hm2；啶虫脒低剂量3.75 g/hm2，高剂量18.75 g/hm2；三唑酮低剂量114 g/hm2，高剂量342 g/hm2。采用一次施药多次采样的方法进行试验，按实际浓度配制农药，均匀地对每个小区进行喷雾施药1次，分别于施药后2 h、1、2、3、5、6、7、9、10、12 d在每个小区内使用随机法采集金银花花蕾约100 g，55 ℃烘干15 h后，放入-20 ℃冰箱中保存。

1.3 样品分析方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦Extend-C18填充柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；紫外检测器；流动相：乙腈:0.4%磷酸溶液(13:87)；流速：1 mL/min；检测波长：327 nm；进样量：5 μL；外标法定量。

1.3.2 样品制备

采用《中国药典》金银花项下绿原酸含量测定方法[16]。精密称取混匀的金银花粉末0.5 g(过四号筛)于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(250 W，35 kHz)30 min，放冷后再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL于25 mL量瓶中，用50%甲醇定容，摇匀，即得。

1.3.3 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品2.08 mg，用50%甲醇溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，摇匀，制得41.6 μg/mL的溶液(10 ℃以下保存)。

1.4 数据分析方法

按照1.2、1.3所述方法对采集样品进行测定，得到不同采样时间、不同施药剂量下金银花中绿原酸的含量，绘制绿原酸含量随采样时间的变化曲线，并用统计学软件SPSS19.0对三种农药的测定结果进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 三种农药处理的金银花中绿原酸含量测定结果

图1 三种农药处理的金银花中绿原酸含量曲线注：a为吡虫啉，b为啶虫脒，c为三唑酮

测定结果表明，空白小区金银花样品中绿原酸含量为2.85～3.34%；吡虫啉低、高剂量小区的绿原酸平均含量分别为3.26～3.73%、3.32～3.90%；啶虫脒低、高剂量小区的绿原酸平均含量分别为2.90～3.40%、2.90～3.61%；三唑酮低、高剂量小区的绿原酸平均含量分别为2.58～2.94%、2.18～2.90%。《中国药典》中规定，金银花中绿原酸含量不得少于1.5%，样品均符合要求[16]。

从图1中可以看出，三种农药对金银花中绿原酸的含量均有一定程度的影响。喷施吡虫啉、啶虫脒后金银花中绿原酸含量均升高，结合上述数据发现啶虫脒处理的样品与吡虫啉相比绿原酸含量升高程度较小；而喷施三唑酮后绿原酸含量降低。三种农药不同喷施剂量样品中绿原酸含量的变化趋势相似，且三种农药对绿原酸含量的影响程度均随喷施剂量的增加而增加。另外，如图1(b)所示，啶虫脒施药组测定结果的波动性较大，出现了施药组含量比空白组低的情况，可能与采集样品的均匀性有关。

2.2 方差分析

表1 三种农药对金银花中绿原酸含量影响的显著性

如表1所示，试验结果的方差分析表明：低、高剂量吡虫啉均对金银花中绿原酸含量具有极显著的影响，但施药剂量的不同对绿原酸含量的影响不显著；低剂量啶虫脒对绿原酸含量无显著影响，高剂量则有极显著的影响，施药剂量的差异对绿原酸含量的影响极显著；低、高剂量三唑酮均对绿原酸含量有极显著的影响，且不同施药剂量对绿原酸含量的影响显著。

3 讨论

3.1 吡虫啉及啶虫脒促进金银花中绿原酸的积累

绿原酸是金银花中具有抗菌、抗病毒药理活性的主要次生代谢产物之一，也是金银花的保护素之一。据报道，当金银花受到异物侵扰后，会提高自身绿原酸的含量，发挥其生物活性，从而抗御伤害进行自我保护[8]。吡虫啉、啶虫脒为新型氯代烟碱类超高效杀虫剂，具有广谱、高效、低毒、对环境安全等特点，并且具有良好的内吸传导性[17-18]。当二者喷施到金银花上后，通过在植物体内的吸收及传导，对植物产生了一定的刺激，可能参与到绿原酸生物合成的一系列酶促反应中，从而导致绿原酸含量增加[1,19]。由图1(a)、(b)可以看出，随着施药剂量的升高，绿原酸含量也有所增加，可能是因为高浓度的农药对绿原酸的生物合成具有更强的刺激作用。有研究发现，硝态氮的存在有利于绿原酸的积累[19]。吡虫啉含有硝基亚胺药效基团，啶虫脒含有氰基亚胺药效基团，可能由于硝基亚胺在植物体内能代谢得到硝态氮，而氰基亚胺不能，因此吡虫啉比啶虫脒更能刺激绿原酸的合成[17,20]。此外，啶虫脒在植物体内的降解动态是前期缓慢，中期加快，后期减缓，这使得啶虫脒施药组对绿原酸合成产生了不同的刺激效应，从而导致绿原酸含量随采样时间出现了一定的波动，出现了含量比空白对照低的情况[18]。

3.2 三唑酮抑制金银花中绿原酸的积累

三唑酮是一种高效、低毒、低残留、内吸性强的三唑类杀菌剂，杀菌机理极为复杂，主要是通过抑制菌体麦角固醇的生物合成，从而发挥抗菌作用，对于治疗白粉病具有特效[21]。如图1(c)所示，在本实验中发现，两剂量处理的金银花中绿原酸含量均有所下降，且施药剂量越高，绿原酸含量下降越明显。由于绿原酸具有抗菌活性，当喷施三唑酮后，可能借助三唑酮对白粉真菌的杀灭作用，金银花自身对抗白粉病的作用下降，导致绿原酸含量下降。另一方面，绿原酸含量的降低可能是因为三唑酮内吸进入植物体后，经过复杂的酶促反应抑制了绿原酸的合成。此外，大量研究发现，高浓度的三唑酮对植物生长具有一定的抑制作用[22]。而在田间试验过程中发现，喷施高剂量三唑酮的金银花植株与空白对照小区相比长势缓慢，新鲜花蕾和嫩叶发出较慢。金银花在二白期、大白期绿原酸含量较高，当使用三唑酮后，可能由于三唑酮抑制了金银花的生长从而干扰金银花的花期，使得绿原酸的含量出现了下降[9]。

3.3 三种农药的使用建议

《中国药典》规定金银花中绿原酸含量不得少于1.5%[16]，所以在金银花的实际种植过程中，可按说明书使用吡虫啉与啶虫脒，而三唑酮应谨慎使用。

综上所述，由于农药对药用植物次生代谢产物的影响比较复杂，所以其具体作用机制还需更为细致地探讨。此外，金银花所含有效成分的种类繁多且含量各异，除绿原酸外，还含有木樨草苷、芦丁、槲皮素等，而农药是否对这些次生代谢产物有所影响，有待借助中药指纹图谱等技术进行深入研究。

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Preliminary Study on the Effect of Commonly Uesd Pesticides onthe Content of Chlorogenic Acid in Loincerae Japonicae Flos

LI Jia-xin1，XUE Jian1，JIN Hong-yu2，MA Shuang-cheng2

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalScience&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China;2.NationalInstitutesforFoodandDrugControl，Beijing100050，China)

Objective: To research the effect on the content of chlorogenic acid in Loincerae Japonicae Flos processed by commonly used pesticides imidacloprid, acetamiprid, triadimefon, which can control diseases and pests, and to provide reference for the rational use of three pesticides.Methods: A field experiment was conducted. The filed plots were sprayed with different concentrations of three pesticides, and the flowers were picked after 2 hours, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10 and 12 days of the application of the pesticides. The pharmacopoeia method was used to determine the content of chlorogenic acid in the samples,and then the results were analyzed by statistical method.Results: Compared with the blank group, the content of chlorogenic acid in the samples with different concentrations of imidacloprid and acetamiprid was increased, while in the samples with different concentrations of triadimefon it was reduced. The impacts of three pesticides on the content of chlorogenic acid were increased with the increasing dose administration. Except the low dose group of acetamiprid, other administration groups all had a significant effect on the content of chlorogenic acid. Conclusion: Imidacloprid and acetamiprid can promote the accumulation of chlorogenic acid in Loincerae Japonicae Flos. However, triadimefon inhibits it. Therefore, we should pay attention when we use them.

Loincerae Japonicae Flos; Imidacloprid; Acetamiprid; Triadimefon; Chlorogenic acid

2016-05-05

2016-11-09

国家重大新药创制专项(2014ZX09304307-002)

李嘉欣(1993-)， 女，硕士研究生，研究方向：中药分析。

*通讯作者：薛健(1964-)，女，研究员，硕士生导师，研究方向：中药有效成分分析及质量控制、中药有害物质研究。

R284.1

A

1002-2392(2017)02-0054-04