金弘,刘婷婷*,刘树民,陈英华,孙晓伟,朴圣爱,祝鹏宇
(1.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学药物安全性评价中心,黑龙江 哈尔滨,150040;3.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨,150001)
电针联合身痛逐瘀胶囊对CCI模型大鼠疼痛及脊髓组织GFAP表达的影响
金弘1,刘婷婷1*,刘树民2,陈英华1,孙晓伟1,朴圣爱1,祝鹏宇3
(1.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学药物安全性评价中心,黑龙江 哈尔滨,150040;3.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨,150001)
目的:通过观察电针联合身痛逐瘀胶囊对CCI大鼠机械缩足反射阈值以及脊髓组织GFAP表达的影响,以期从抑制脊髓组织胶质细胞活化角度揭示其作用机制。方法:将成年SD大鼠通过随机数字表分为假手术组、模型组、电针组、中药组和针药组,每组分为3 d,7 d和14 d三个亚组,每个亚组10只大鼠。按照Bennett的方法建立CCI大鼠模型,电针组给予损伤侧环跳、阳陵泉电针治疗,每日1次,每次30 min。中药组给予身痛逐瘀胶囊治疗(1.64 g/kg),灌胃给药,给药容积为15 mL/kg,每日1次。针药组给予电针和中药联合治疗,方法及疗程同上。假手术组和模型组给予等容积生理盐水灌胃。采用机械缩足反射阈值进行大鼠行为学检测;采用RT-PCR法检测CCI模型大鼠脊髓组织GFAP mRNA的表达。结果:MWT检测结果显示,模型组大鼠MWT从术后3天即显著降低,术后各时间点与假手术组相比具有显著差异(P<0.05);电针组、中药组、针药组CCI大鼠MWT有所上升,各时间点与模型组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。针药组大鼠MWT显著上升,与电针组、中药组相比,疗效更加显著(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,模型组术后各时间点脊髓组织中GFAP mRNA的相对表达量显著升高(P<0.05),与假手术组比较差异显著(P<0.05)。治疗后电针组、中药组、针药组脊髓组织中GFAP mRNA的相对表达量明显降低(P<0.05),与模型组相比差异显著(P<0.05)。治疗后针药组GFAP mRNA的相对表达量明显降低(P<0.05),与电针组、中药组比较差异显著(P<0.05)。以上结果表明,电针组、中药组、针药组均能抑制CCI模型大鼠脊髓组织GFAP mRNA的表达,尤以针药组疗效更佳。结论:电针联合身痛逐瘀胶囊能够显著改善CCI模型大鼠机械缩足反射阈值,其作用机制可能与其抑制脊髓组织中GFAP mRNA表达上调有关。
神经病理性疼痛;电针;身痛逐瘀胶囊;GFAP
神经病理性疼痛由于发病机制复杂,目前临床仍缺乏行之有效的治疗方法[1]。既往研究认为[2],胶质细胞在神经系统中仅具有对神经细胞进行支持和保护的作用,其并不参与以神经元之间信号传递为主要方式的痛觉传导。然而,近年来有研究发现[3],胶质细胞在神经病理性疼痛的发生和发展过程中起着重要的作用,因此,越来越多的研究开始关注神经病理性疼痛发病机制中胶质细胞的调控作用。有学者认为,对中枢神经系统中以星形胶质细胞为代表的神经胶质细胞进行深入研究,有望为神经病理性疼痛的治疗揭开新的篇章。神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是中枢神经系统中星形胶质细胞胞质内特有的中间丝蛋白,其表达量会随着机体受到刺激后星形胶质细胞的活化而增加[4]。因此,GFAP的表达量显著增加被认为是神经病理性疼痛病理机制中星形胶质细胞被激活最特异的标志。
针灸和中药治疗以坐骨神经痛为代表的神经病理性疼痛取得满意疗效,其具有疗效显著且副作用小等优点,逐渐得到广泛认可[5-7]。自2014年至今研究采用电针联合身痛逐瘀汤治疗坐骨神经痛患者,临床疗效确切,然而其作用机制尚不明确。其抑制疼痛作用是否与影响胶质细胞活化具有相关性目前尚无报道。据此,本课题组采用CCI模型大鼠为研究对象,观察电针联合身痛逐瘀胶囊对胶质细胞活化的影响,以期从分子生物学角度揭示其治疗神经病理性疼痛的作用机制,为其临床应用提供理论支持和实验依据。
1.1 实验动物与分组
选用清洁级健康成年雄性SD大鼠150只,体质量(250±30)g,由黑龙江中医药大学动物实验中心提供(动物合格证号SCXK(黑)2008004 )。动物在实验室适应性饲养一周后,采用随机数字表法将实验大鼠分为5组,即假手术组、模型组、电针组、中药组、针药组,每组各30只。每组又分为3 d,7 d,14 d三个亚组,每个亚组10只大鼠。
1.2 主要实验仪器和试剂
Von Frey Hairs(Stoeling,美国);高速离心机(CS-15R,美国Beckman);实时荧光定量PCR仪(Roche 480 Ⅱ,罗氏);华佗针灸针(苏州医疗设备厂,中国);电针仪(KWD-801,中国英迪)。Realtime PCR试剂盒(Takara,日本);身痛逐瘀胶囊(规格:0.35 g/粒,黑龙江中医药大学中医药研究院,批号:20110513)。
1.3 动物模型制备
按照Bennett的方法[8]建立CCI模型,大鼠称体质量后,腹腔注射水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉,俯卧,用橡皮筋固定四肢于自制的鼠板上,用弯剪刀将左侧后肢大腿部剃毛后用碘伏消毒,在大鼠左侧股骨中上1/3处行纵形切口,钝性分离局部肌肉,暴露并分离坐骨神经主干,选择4-0号铬制羊肠线在在坐骨神经主干部位结扎4道,两道之间间隔约1.0 mm,然后逐层缝合皮肤肌肉。假手术组大鼠暴露坐骨神经主干后,不进行结扎,逐层缝合皮肤肌肉。
1.4 治疗方法
假手术组:术后大鼠常规饲养,直至相应时间点实验结束,其余未经任何治疗。
模型组:术后大鼠常规饲养,直至相应时间点实验结束,其余未经任何治疗。
电针组:选穴:环跳、阳陵泉(损伤侧)。操作:依据大鼠穴位图谱确定环跳穴及阳陵泉穴定位,针具和穴位局部皮肤常规消毒后,选用华佗牌一次性针灸针(0.25 mm×25 mm),快速进针,同侧环跳和阳陵泉穴接电针仪,上正下负,选择疏密波[9],频率和电流为,以局部肌肉轻微颤动为度,每日1次,每次留针30 min。
中药组[10]:取身痛逐瘀胶囊囊心药粉1.64 g加生理盐水溶解为100 mL,制成身痛逐瘀胶囊混悬液,灌胃给药,给药容积为15 mL/kg,每日1次,连续治疗相应疗程。
针药组:给予电针和中药联合治疗,方法及疗程同上。
保证动物饲养室温度为21~24℃,室内湿度50%~70%,12 h交替照明,自由进食和饮水。各组大鼠分笼饲养,每笼4~5只大鼠。各组分别于术后3 d,7 d,14 d进行行为学检测及取材。
1.5 观察指标及检测方法
1.5.1 机械缩足反射阈值(Mechanical Withdrawal Threshold,MWT)的测定
用透明有机玻璃自制玻璃箱(22×12×22 cm3),底部置一孔径为0.5×0.5 cm2的铁丝网,将大鼠置于透明的玻璃箱中,适应15 min。实验前使之适应15 min。然后从2.0 g开始分别以不同折力的von Frey细丝刺激大鼠的足底,运用up and down法推测大鼠缩足反射阈值,然后在阈值上下分别刺激大鼠5次,用内推法算出每只大鼠引起5次试验中2.5次反应的值作为50%反应阈值。每次刺激后间隔15 s,待大鼠行为反应完全消失后再进行下一次刺激[11]。
1.5.2 动物取材及检测
各组大鼠分别在术后3 d、7 d和14 d行为学检测后,用10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 mg/kg),迅速开胸,暴露心脏,将注射器针头快速插入左心室,固定针头后缓慢注入生理盐水,直至清澈透亮的液体自右心耳流出,接着用注射器缓慢注入4%多聚甲醛溶液,直至大鼠出现四肢抽搐,皮肤、肺脏、肝脏及眼睑变白等表现,迅速断头,取出大鼠腰膨大部位的脊髓(相当于L4-L6脊髓),长度大约1 cm,迅速置于液氮中,-80℃保存备用,每组取材6只。提取总RNA,逆转录,PCR仪扩增。PCR扩增条件为:94℃预变性5 min,94℃ 40 s,46℃ 30 s,40个循环。根据公式2-ΔΔCt方法计算GFAP mRNA的相对表达量。
1.6 统计学处理
2.1 机械缩足反射阈值检测结果
结果表明,模型组大鼠MWT从术后3 d即显著降低,术后7 d达到最低值,术后14 d有所升高,但仍显著低于术前,术后各时间点与假手术组相比具有显著差异(P<0.05);电针组、中药组、针药组CCI大鼠机械缩足反射阈值有所上升,各时间点与模型组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。针药组大鼠机械缩足反射阈值显著上升,与电针组、中药组相比,疗效更加显著(P<0.05)。见表1。
表1 各组CCI大鼠机械缩足反射阈值检测结果±s,n=6)
注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与针刺组比较,▽P<0.05;与中药组比较,#P<0.05
2.2 各组大鼠脊髓组织GFAP mRNA的表达
结果显示,模型组术后各时间点脊髓组织中GFAP mRNA的相对表达量显著升高(P<0.05),与假手术组比较差异显著(P<0.05)。治疗后电针组、中药组、针药组脊髓组织中GFAP mRNA的相对表达量明显降低(P<0.05),与模型组相比差异显著(P<0.05)。治疗后针药组GFAP mRNA的相对表达量明显降低(P<0.05),与电针组、中药组比较差异显著(P<0.05)。以上结果表明,电针组、中药组、针药组均能抑制CCI模型大鼠脊髓组织GFAP mRNA的表达,尤以针药组疗效更佳。见表2。
表2 各组CCI大鼠脊髓组织GFAP mRNA的相对表达量
注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与针刺组比较,▽P<0.05;与中药组比较,#P<0.05
CCI模型大鼠能够较好的模拟临床发病率较高的坐骨神经痛,该病属于祖国医学“痹症”和“腰腿痛”的范畴[12],经数据挖掘和文献整理发现,针灸治疗该病取穴较多的为环跳穴和阳陵泉穴,笔者在临床运用环跳和阳陵泉电针治疗坐骨神经痛取得较好疗效。现代研究表明,电刺激具有较好的抗炎镇痛作用,其中,低频率的电刺激能够引起脑垂体释放β内啡肽和脑啡肽增多,两者可以分别作用于μ和δ受体而起到镇痛作用,但作用较为缓慢持久;而高频率的电刺激能够引起脊髓释放强啡肽增多,从而作用于κ受体,产生即时的镇痛作用[13],因此本研究选择疏密波治疗,以最大程度的改善患者疼痛症状。既往研究也发现[9],电针疏密波能够显著上调急性痛风性关节炎模型大鼠足踝关节滑膜内HSP70蛋白表达,达到减轻局部炎症反应、缓解疼痛的作用,疗效优于疏波和密波。身痛逐瘀胶囊是清代名医王清任在《医林改错》中所载的身痛逐瘀汤制成的成方制剂,方中川芎、桃仁、当归和红花具有活血化瘀之功效;地龙、牛膝、秦艽、羌活和五灵脂具有活血化瘀并能强筋止痛的作用;香附具有调经活血、理气疏肝之效;没药能够消肿生肌并活血止痛;甘草调和诸药,并能清热解毒、祛痰止痛。诸药合用,共奏活血化瘀、通络止痛之功效[14]。现代研究表明,身痛逐瘀汤能够显著下调冰醋酸和福尔马林诱导的疼痛小鼠血清中MDA、NO以及PGE2的水平,上调SOD的水平,从而发挥中枢和外周镇痛作用[10]。
正常情况下,GFAP作为一种中间丝蛋白,仅存在与中枢神经系统的星形胶质细胞中。其阳性表达量会随着机体受到刺激后,星形胶质细胞被激活而增多。Garrison等[15]在1991年即通过研究发现大鼠坐骨神经损伤侧脊髓组织中GFAP阳性表达较对侧显著增加,并且其表达量也与大鼠坐骨神经结扎疼痛模型的痛觉过敏程度呈正比。这一结果提示了GFAP作为星形胶质细胞活化的标志物,星形胶质细胞被激活可能参与了神经病理性疼痛的病理过程。此后,越来越多的研究关注星形胶质细胞活化在神经病理性疼痛模型中的重要作用[16]。进一步研究发现[17],神经病理性疼痛模型中,星形胶质细胞活化,分泌大量GFAP蛋白,并且星形胶质细胞形态也发生相应变化,常见的包括细胞变大,突起变长等。因此,GFAP目前已经作为公认的星形胶质细胞标记性蛋白。本实验研究结果证实,模型组术后各时间点脊髓组织中GFAP mRNA的相对表达量显著升高(P<0.05),与假手术组比较差异显著(P<0.05),说明CCI后机体星形胶质细胞被激活,从而使GFAP的阳性表达量增多。治疗后电针组、中药组、针药组脊髓组织中GFAP mRNA的相对表达量明显降低(P<0.05),与模型组相比差异显著(P<0.05)。治疗后针药组GFAP mRNA的相对表达量明显降低(P<0.05),与电针组、中药组比较差异显著(P<0.05)。以上结果表明,电针组、中药组、针药组均能抑制CCI模型大鼠脊髓组织GFAP mRNA的表达,尤以针药组疗效更佳。
综上所述,电针联合身痛逐瘀胶囊能够显著改善CCI模型大鼠机械缩足反射阈值,其作用机制可能与其抑制脊髓组织中GFAP mRNA表达上调有关。
[1] 赵佳丽,陈秋红,李红娜,等.神经病理性疼痛的药物治疗进展[J].药学实践杂志,2016,34(4):309-312.
[2] 沈维高,何欣,王振江.星形胶质细胞的生物学功能及其与疾病的关系研究进展[J].北华大学学报(自然科学版),2008,9(6):501-509.
[3] 高永静,纪如荣.星形胶质细胞调节慢性疼痛的分子机制[J].中国疼痛医学杂志,2013,19(9):545-552.
[4] 韩玉生,宫鑫梅,孙洪恩,等.针刺对更年期脑缺血大鼠GFAP和OX42表达的影响[J].针灸临床杂志,2011,27(12):49-52.
[5] 潘宁芳,杜俊英,俞婕,等.神经病理性疼痛机制及电针干预作用的研究进展[J].上海针灸杂志,2017,36(1):103-107.
[6] 叶晓春,赵普,王亮,等.电针腰椎夹脊穴治疗根性坐骨神经痛的临床疗效观察[J].中医药信息,2015,32(1):108-111.
[7] 栗明,曹彬彬,苑海刚.乌芪通络胶囊对实验性大鼠坐骨神经VEGF及ROS影响的实验研究[J].中医药信息,2014,31(6):101-104.
[8] Bennett,G.J. and YK. Xie, A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man[J]. Pain,1988,33(1):87-107.
[9] 金弘,刘婷婷,陈英华,等.电针的不同波形对实验性大鼠急性痛风性关节炎滑膜组织中HSP70表达的影响[J].针灸临床杂志,2012,28(7):64-66.
[10] 阮洪生,刘树民.身痛逐瘀胶囊对醋酸致痛小鼠血清中NO、SOD、MDA、PGE2的影响[J].中药药理与临床,2013,29(5):6-8.
[11] Chaplan, S.R.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw[J].J Neurosci Methods,1994,53(1):55-63.
[12] 吴曦,晋松,陈敏,等.电针为主治疗腰椎间盘突出所致坐骨神经痛:多中心随机对照试验[J].成都中医药大学学报,2015,38(2):43-47.
[13] Han JS, Chen XH, Sun SL, et al. Effect of low- and high-frequency TENS on Met-enkephalin-Arg-Phe and dynorphin A immunoreactivity in human lumbar CSF [J]. Pain,1991,47(3):295-298.
[14] 金杰.推拿法结合身痛祛瘀汤治疗气滞血瘀型腰痛效果观察[J].陕西中医,2017,38(1):105-106.
[15] Garrison CJ, Dougherty PM, Kajander KC, et al. Staining of glial fibrillary acidic protein (GFAP) lumbar spinal cord increases following a sciatic nerve constriction injury[J]. Brain Res,1991,565(1):1-7.
[16] Mei XP, Wang W, Wang W, et al. Combining ketamine with astrocytic inhibitor as a potential analgesic strategy for neuropathic pain ketamine, astrocytic inhibitor and pain[J].Mol Pain,2010,6(6):50-55.
[17] Ledeboer A, Sloane EM, Milligan ED, et al. Minocycline attenuates mechanical allodynia and proinflammatory cytokine expression in rat models of pain facilitation[J].Pain,2005,115(1-2):71-83.
Effect of Electroacupuncture Combined with Shentong Zhuyu Capsuleon Pain and Expression of GFAP in CCI Model Rats
JIN Hong1,LIU Ting-ting1,LIU Shu-min2,CHEN Ying-hua1,SUN Xiao-wei1,
PIAO Sheng-ai1,ZHU Peng-yu3
(1.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,ChineseAcademyofMedicalSciences,Harbin150040,China;3.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)
Objective: To observe the effect of electroacupuncture combined with Shentong Zhuyu capsule on the threshold of mechanical compression and the expression of GFAP in spinal cord tissue of CCI rats in order to reveal its mechanism from the inhibition of glial cell activation in spinal cord tissue. Methods: Adult SD rats were randomly divided into sham operation group, model group, electroacupuncture group, traditional Chinese medicine group and acupuncture combined with Chinese medicine group. Each group was divided into three subgroups: 3 days, 7 days and 14 days,with 10 rats in each subgroup. According to Bennett method to establish CCI rat models, electroacupuncture group received Sunshang Cehuan Tiao therapy,Yanglingquan electroacupuncture treatment,once per day with 30min. Chinese medicine group received Shentong Zhuyu capsule treatment (1.64 g/kg), administered by intragastric administration, administration volume of 15 ml/kg, once per day. Acupuncture combined with Chinese medicine group received acupuncture and traditional Chinese medicine treatment,with the same methods and treatment above. Sham operation group and model group were given equal volume of saline. The expression of GFAP mRNA in the spinal cord of CCI model rats was detected by RT-PCR. The expression of GFAP mRNA was detected by RT-PCR. Results: The MWT test showed that the MWT of the model group was significantly decreased after operation of 3 days, and there was a significant difference between two groups (P<0.05). In the acupuncture group, the traditional Chinese of medicine group, the acupuncture combined with Chinese medicine group MWT of CCI rats was increased, and the difference was statistically significant (P<0.05) at each time point compared with that in the model group. The MWT of acupuncture combined with Chinese medicine group was significantly higher than that of the acupuncture group and the traditional Chinese medicine group (P<0.05). The relative expression of GFAP mRNA in the spinal cord tissue was significantly higher than that in the sham operation group (P<0.05), and the expression of GFAP mRNA in the model group was significantly higher than that in the sham operation group (P<0.05). The relative expression of GFAP mRNA in spinal cord tissue of acupuncture group, Chinese medicine group and acupuncture combined with Chinese medicine group was significantly lower than that of model group (P<0.05). The relative expression of GFAP mRNA in the acupuncture combined with Chinese medicine group was significantly lower than that in the acupuncture group and the traditional Chinese medicine group (P<0.05). The results showed that acupuncture group, traditional Chinese medicine group and acupuncture combined with Chinese medicine group could inhibit the expression of GFAP mRNA in spinal cord tissue of CCI model rats, especially in acupuncture combined with Chinese medicine group. Conclusion: Electroacupuncture combined with Shentong Zhuyu capsule can significantly improve the threshold of mechanical compression in CCI model rats, and its mechanism may be related to the inhibition of GFAP mRNA expression in spinal cord tissue.
Neuropathic pain; Electroacupuncture; Shentong Zhuyu capsule; GFAP
2016-12-20
2017-02-16
黑龙江省自然科学基金项目(H2015034);黑龙江省博士后基金项目(LBH-Z12264);黑龙江中医药大学科研基金项目(035143)
金弘(1978-),男,副主任医师,主要从事针刺对各种疼痛性疾病的临床与机理研究。
*通讯作者:刘婷婷(1979-),女,副教授,主要从事针灸治疗神经系统疾病的研究。
R246.6;R741
A
1002-2392(2017)02-0033-04