不同途径注射卵蛋白致大鼠过敏性休克的研究

解朝稳，陈 阳

(皖南医学院 法医学院，安徽 芜湖 241002)

·法医学·

不同途径注射卵蛋白致大鼠过敏性休克的研究

解朝稳，陈 阳

(皖南医学院 法医学院，安徽 芜湖 241002)

目的：建立不同途径致大鼠过敏性休克动物模型，找到相对高效的造模方式。 方法：将健康SD大鼠随机分为正常对照组和致敏1、2、3组,致敏组分别于第 1 天不同部位注射致敏原,第5天加强注射1次,饲养第18天不同部位注射致敏原激发过敏性休克。 结果：①致敏组大鼠均出现过敏性休克的典型体征，且尾静脉注射致敏原激发过敏性休克致敏组的症状比较严重；②致敏组与正常对照组比较血清IgE、类糜蛋白酶含量升高，致敏1组血清含量高于其他致敏组，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：本实验成功地建立了大鼠过敏性休克动物模型，证明最后一次激发大鼠过敏性休克的注射途径，应选择尾静脉比较理想。

过敏性休克；免疫球蛋白E；类糜蛋白酶

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2017.02.004

过敏性休克(anaphylactic shock)是IgE介导的最为危重的一种Ⅰ型超敏反应性疾病。致敏患者通常在接触过敏原后数分钟内出现症状，可能引发突然死亡，其中由药物、血清等致敏原引起的过敏性休克在临床上较为常见[1-3]。 然而，通常过敏性休克的法医学尸体检验所见仅为肺淤血或咽喉部水肿等非特异改变，一直是法医学鉴定中的一大难题[4]。Yunginger等[5]认为血清中总IgE和特异性IgE水平可以作为过敏性休克死后较可靠的指标。血清中IgE含量过高，常提示Ⅰ型超敏反应或遗传过敏体质的存在,因此常根据血清中IgE水平诊断变态反应疾病[6-7]。肥大细胞类糜蛋白酶是其分泌颗粒中的丝氨酸蛋白酶，平时仅有少量分泌到血液及体液中，但当肥大细胞被激活、脱颗粒时则大量释放入血液或体液中，导致血液或体液中类糜蛋白酶的含量急剧增高。作为肥大细胞的特异性标记物，肥大细胞类糜蛋白酶已成为学者研究过敏性疾病的敏感指标之一[8]。本文拟建立不同途径注射卵蛋白致大鼠过敏性休克的动物模型，并检测IgE、类糜蛋白酶含量作为造模依据,从而找到比较高效的造模途径，这样在此基础上可以使动物过敏性休克的实验数据更加准确，为法医学鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 20只SD雄性大鼠，清洁级，体质量(190± 10)g,苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司提供，批号为SCXK(苏)2014-0007;实验前适应性喂养1周，而后定时定量喂养。

1.2 实验器材与试剂 常规手术器械和包埋、切片及HE染色所需材料；鸡卵蛋白 OVA ( Grade Ⅱ )、氟氏完全佐剂(美国Sigma 公司)，大鼠 IgE、类糜蛋白酶ELISA 试剂盒 48孔(苏州卡尔文生物科技有限公司),酶标仪。

1.3 动物分组及模型建立 将20只SD雄性大鼠随机分为四组(每组5只)：正常对照组及致敏1、2、3组。致敏组大鼠分别于 第1、5天注射20 mg卵蛋白(溶于 0.5 mL 生理盐水，与佐剂等体积混合)，自首次给药后第 18 天，不同部位注射100 mg卵蛋白(溶于 1 mL 生理盐水，不含佐剂)，激发大鼠过敏性休克[11-12]，观察大鼠行为，记录休克反应；正常对照组给予相同剂量的生理盐水替代致敏原。具体方法见表1。

表1 不同途径注射方法

组别第1、5天第18天正常对照组腹腔注射尾静脉注射致敏1组腹腔注射尾静脉注射致敏2组腹腔注射后肢皮下注射致敏3组后肢皮下注射腹腔注射

1.4 ELISA 法检测 IgE、类糜蛋白酶水平 大鼠过敏性休克后观察2 h颈椎脱臼处死，立即取颈动脉血液，取离心后上清液，分装 4℃ 冷藏。第2天采用ELISA试剂盒检测样本中 IgE、类糜蛋白酶的水平，方法按说明书进行。 最后15 min 内在波长 450 nm 的酶标仪上测定各孔的光密度值( OD 值)，以此计算样本浓度，计算的样本浓度X5即为样本实际浓度(按说明书规定)。

1.5 病理组织学检查 取大鼠肺组织，用10%甲醛固定两天，对其进行石蜡包埋连续切片，HE染色，光镜下观察变化。

2 结果

2.1 过敏性休克动物表现 过敏性休克大鼠致敏原激发后，活动减少，搔抓腹部，呼吸困难，趴伏，致敏2组和3组大鼠轻度抽搐，约10 s,致敏1组抽搐时间较长，约20 s,观察2 h 内未死亡(致敏大鼠过敏性休克率为 100%);对照组无异常表现。

2.2 大鼠过敏性休克血清中IgE、类糜蛋白酶水平 不同组的血清中IgE、类糜蛋白酶水平见表2，差异有统计学意义(P<0．05)。致敏1组与正常对照组比较IgE升高、类糜蛋白酶含量升高(P<0．01)，致敏2、3组与正常对照组比较IgE、类糜蛋白酶含量升高(P<0．05)；尾静脉注射致敏原激发过敏性休克致敏组中的血清IgE、类糜蛋白酶含量高于其他致敏组，差异具有统计学意义(P<0.05)；所测值见表2。

组别IgE类糜蛋白酶正常对照组3.1716±0.67741.9528±0.2099致敏1组6.0314±1.0068*5.2299±0.4772*致敏2组4.4140±0.5609*#4.0674±0.2703*#致敏3组4.4197±0.5185*#4.1569±0.2823*#F值13.37088.642P值<0.01<0.01

*与正常对照组比较，P<0.05；#与致敏1组比较，P<0.05。

2.3 各组肺组织HE镜下改变 对照组(图1a)肺泡无异常；解剖见致敏组死亡大鼠肺组织水肿、淤血，对照组无异常；HE镜下见致敏1组(图1b)肺泡淤血较严重，中度淤血；致敏2、3组(图1c、d)肺泡淤血较轻，轻度淤血。

a:正常对照组;b:致敏1组;c:致敏2组;d:致敏3组。

图1 肺组织镜下改变 (HE×400)

3 讨论

过敏性休克死亡在法医学鉴定中比较常见，但由于缺乏特异的病理学改变[9]，为鉴定带来一定的困难。目前的鉴定实践中，诊断过敏性休克通常在排除暴力性死亡、中毒及其他自然性疾病的基础上，结合过敏原接触史、解剖发现、死后血清IgE水平等进行综合判断[10]。一直以来，寻找敏感可信的生化诊断指标成为临床医学和法医学领域努力探索的方向。所以过敏性休克动物模型的建立可为寻找敏感可信的诊断指标提供基础。本实验通过借鉴[11-12]的造模方法及剂量，采用不同途径注射卵蛋白致大鼠过敏性休克，并用血清IgE、类糜蛋白酶水平进行判断，希望找到比较高效的造模途径。实验证实首次注射及加强注射致敏原选择腹腔或皮下对造模是否成功没有多大影响，但最后一次激发过敏性休克选择静脉比较合适，例如大鼠尾静脉，这样可以提高造模成功率。虽然最后一次激发过敏性休克选择皮下或腹腔也能造模成功，其血清IgE、类糜蛋白酶水平与正常对照组差异有统计学意义；但是尾静脉注射时，其过敏性休克症状更严重，比较其血清IgE、类糜蛋白酶水平也较其他两组高，具有统计学意义。

综上所述，过敏性休克动物造模应选择最后一次静脉注射致敏原的注射途径，这样比较理想，例如尾静脉；并且其血液生化指标 IgE、类糜蛋白酶可以作为诊断造模成功率的依据，但应及时取血冷藏保存，防止样本溶血，并及时提取检材。

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Development of anaphylactic shock rat models induced by ovalbumin injected via different routes

XIE Chaowen,CHEN Yang

School of Forensic Medicine,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective：To verify a relatively efficient modeling technique for anaphylactic shock in rats induced by different routes of administration of ovalbumin.Methods:Healthy SD rats were randomly divided into normal control group and sensitized group 1,2 and 3.Rats in the three sensitized groups were sensitized by injection of the allergen via different routes in the day 1,and additional dose in the day 5.Then the rats were fed for 18 days,and challenged for the anaphylactic shock in the 18th day by ovalbumin administration in different routes.Results：①Rats in the sensitized group showed typical signs of anaphylactic shock in general,yet the symptoms appeared severer in rats sensitized by injection of the allergen via tail vein;②Rats in the sensitized group had higher levels of IgE and chymase than the control group,and higher serum IgE and chymase levels were observed in sensitized group 1(P<0.05).Conclusion:Anaphylactic shock model was successfully developed in rats.However,the trials indicate that injection of the allergen via tail vein will result in optimal modeling in such animals.

anaphylactic shock;immunoglobulin E;chymase

1002-0217(2017)02-0114-03

2016-08-26

解朝稳(1987-)，男，2014级硕士研究生，(电话)18895327802，(电子信箱)906572990@qq.com； 陈 阳，男，副教授，硕士生导师，(电子信箱)chy5454@163.com，通信作者。

R 593.1;R 363

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