脂多糖对胰腺星状细胞Smad和ERK1/2信号通路相关蛋白表达的影响

张青 陈凯 卢美丽 许威 向晓辉 夏时海 冀润利

·论著·

脂多糖对胰腺星状细胞Smad和ERK1/2信号通路相关蛋白表达的影响

张青 陈凯 卢美丽 许威 向晓辉 夏时海 冀润利

目的 探讨脂多糖(LPS)干预对胰腺星状细胞(PSC)Smad和ERK1/2信号通路相关蛋白表达的影响。方法 体外培养大鼠PSC细胞株LTC-14，用不同浓度LPS和不同时间干预LTC-14细胞，采用蛋白质印迹法检测细胞Smad、ERK1/2通路相关蛋白以及α-平滑肌肌动(α-SMA)蛋白的表达。结果 0、1、5、10、20、50 mg/L LPS干预LTC-14细胞后，Smad3的蛋白表达量分别为0.15±0.02、0.37±0.02、0.44±0.01、0.46±0.02、0.37±0.01、0.24±0.03，Smad7蛋白表达量分别为0.79±0.05、0.84±0.02、0.55±0.03、0.45±0.03、0.34±0.02、0.92±0.07，p-ERK1/2蛋白表达量分别为0.48±0.05、0.74±0.03、0.72±0.04、0.89±0.02、0.81±0.02、0.72±0.03，p-cPLA2蛋白表达量分别为0.15±0.03、0.30±0.01、0.31±0.01、0.30±0.02、0.28±0.03、0.32±0.02，α-SMA蛋白表达量分别为0.56±0.06、0.62±0.06、0.54±0.04、1.03±0.11、1.39±0.08、1.28±0.10，均在LPS干预后发生显著变化(P值均<0.01)；ERK1/2蛋白表达量分别为0.56±0.03、0.57±0.02、0.53±0.02、0.58±0.02、0.59±0.05、0.55±0.04，未随着LPS浓度的升高而发生显著变化。10 mg/L LPS干预0、1、3、6、9 h后，LTC-14细胞Smad3蛋白表达量分别为0.69±0.05、0.68±0.07、1.02±0.14、1.82±0.06、2.04±0.11，Smad7蛋白表达量分别为2.77±0.10、1.37±0.08、1.45±0.14、0.78±0.09、0.63±0.06，p-ERK1/2蛋白表达量分别为0.16±0.03、0.32±0.05、0.79±0.03、1.50±0.07、1.77±0.04， p-cPLA2蛋白表达量分别为0.15±0.04、0.32±0.06、0.63±0.04、0.95±0.04、1.49±0.10，α-SMA的蛋白表达量分别为0.84±0.03、1.26±0.21、1.81±0.19、4.28±0.26、4.37±0.15，均随着LPS干预时间的延长而发生显著变化(P值均<0.05或<0.01)；ERK1/2蛋白表达量分别为0.75±0.03、0.72±0.02、0.80±0.04、0.74±0.03、0.85±0.09，不随LPS干预时间的延长而发生显著变化。结论 LPS呈时间-剂量依赖性上调α-SMA表达，并激活胞内Smad和ERK1/2炎症通路，这可能是CP发生的分子机制之一。

胰腺； 脂多糖类； 星型细胞； 信号传导

慢性胰腺炎(CP)是由多种原因所致的胰腺实质内腺泡和胰管的反复或持续性损伤，引起腺泡和胰岛细胞萎缩或消失，最终被纤维组织代替。CP临床表现多样，早期不易诊断。近年来大量研究显示CP患者胰腺星状细胞(pancreatic stellate cell, PSC)的活化程度与胰腺组织纤维化程度呈正相关， PSC 在胰腺慢性纤维化的进程中具有重要作用，是各种诱因作用的靶点，也是导致CP 纤维化的重要物质基础[1]。在CP起因的众多假说中，肠道屏障破坏造成的细菌易位、反复的炎症刺激是CP的主要成因之一。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是细菌细胞壁的主要成分，也是主要的致炎因素，可以通过TGF-β1通路诱导多器官的炎症反应[2-3]。大鼠PSC中TGF-β1的分泌依赖于Smad和ERK1/2信号通路[4]。Smad3表达升高与PSC的激活有关[5]，而Smad7高表达的小鼠，胰腺纤维化程度减轻[6]；p-ERK1/2表达升高可以激活PSC[7]，胞质型磷脂酶 A2(cytosolic phospholipase A2，cPLA2)作为ERK1/2通路的下游分子，是炎症反应的关键酶，在多种炎症反应中发挥作用[8]。由此推测LPS诱导PSC活化所发生的炎症反应可能有Smad和ERK1/2信号通路的参与。本研究应用LPS刺激PSC，观察其对Smad和ERK1/2信号通路相关蛋白表达的影响，探讨CP发生的分子机制。

材料和方法

一、细胞株及试剂

LTC-14细胞株是从大鼠胰腺分离出来的PSC，由德国Rostock大学医学院Robert Jaster教授惠赠[9]；胎牛血清购自Gibco公司；青链霉素混合液购自Solarbio公司；IMDM培养基购自HyClone公司；LPS购自Sigma公司；胰酶消化液购自Gibco公司； ERK、β-actin单克隆一抗购自Proteintech公司； Smad3、Smad7抗体购自Abcam公司；p-ERK、p-cPLA2抗体购自Sigma公司；DMSO购自Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京碧云天生物技术有限责任公司；PVDF膜购自BD公司；蛋白Marker购自Solarbio公司；ECL发光液购自碧云天公司；显影胶片购自柯达公司；显影粉和定影粉购自天津世纪奥博公司。

二、细胞培养及分组

LTC-14细胞复苏后常规培养、传代。取对数生长期LTC-14细胞，待细胞70%融合时更换无血清培养液，分别加入0、1、5、10、20、50 mg/L LPS干预3 h，弃培养液，加入RIPA裂解液裂解细胞，提取蛋白；另取对数生长期LTC-14细胞，待细胞70%融合时更换无血清培养基，加入10 mg/L LPS分别干预0、1、3、6、9 h，弃去培养基，加入RIPA裂解液裂解细胞，提取蛋白。

三、蛋白质印迹法检测细胞相关通路的蛋白表达

取上述提取的蛋白，BCA定量后常规行蛋白质印迹法检测细胞α-SMA、Smad3、Smad7、p-ERK1/2、ERK、p-cPLA2蛋白表达，一抗工作浓度均为1∶1 000，内参GAPDH工作浓度为1∶5 000， HRP标记的二抗工作浓度为1∶5 000，最后用ECL化学发光显影。

四、统计学处理

结 果

一、LPS干预对LTC-14细胞 Smad3、Smad7表达的影响

LPS干预后LTC-14细胞Smad3蛋白表达量先随LPS剂量的增加而增加，在10 mg/L时达峰值，其后又逐渐下降；Smad7蛋白表达量先随LPS剂量增加而下降，在20 mg/L时达最低值，50 mg/L时又显著升高(表1，图1A)。LTC-14细胞Smad3蛋白表达量随10 μg/ml LPS干预时间的延长而增加；Smad7蛋白表达量随LPS干预时间的延长而减少(表2，图1B)。

表1 不同浓度LPS干预后LTC-14细胞Smad3、Smad7蛋白表达量的变化

注：与0 mg/L组比较，aP<0.01

表2 10 mg/L LPS干预不同时间后LTC-14细胞Smad3、Smad7蛋白表达量的变化

注：与0 h组比较，aP<0.01

图1 0、1、5、10、20、50 mg/L LPS干预3 h后(1A)及10 mg/L LPS干预0、1、3、6、9 h后(1B) LTC-14细胞Smad3、Smad7蛋白的表达

二、LPS干预对LTC-14细胞ERK1/2信号通路的影响

LPS干预后LTC-14细胞p-ERK1/2、p-cPLA2蛋白表达量增加；而LPS干预对ERK1/2蛋白表达没有影响(表3，图2A)。10 mg/L LPS干预后LTC-14细胞p-ERK1/2、p-cPLA2蛋白表达量随干预时间的延长而增加，在9 h时达峰值；而干预时间的延长对ERK1/2的表达没有影响(表4，图2B)。

三、LPS干预对LTC-14细胞α-SMA表达的影响

0、1、5、10、20、50 mg/L LPS干预后LTC-14细胞α-SMA蛋白表达量分别为0.56±0.06、0.62±0.06、0.54±0.04、1.03±0.11、1.39±0.08、1.28±0.10，≥10 mg/L LPS干预后LTC-14细胞α-SMA蛋白表达量显著高于未干预细胞，差异均有统计学意义(P值均<0.01，图3A)。

10 μg/ml LPS干预0、1、3、6、9 h后LTC-14细胞α-SMA蛋白表达量分别为0.84±0.03、1.26±0.21、1.81±0.19、4.28±0.26、4.37±0.15，随干预时间的延长逐渐升高，6 h时达峰值(图3B)，干预时间≥3 h时的表达量显著高于未干预细胞，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。

图2 0、1、5、10、20、50 mg/L LPS干预3 h后(2A)及10 mg/L LPS干预0、1、3、6、9 h后(2B ) LTC-14细胞 p-ERK1/2、ERK1/2、p-cPLA2蛋白的表达

图3 0、1、5、10、20、50 μg/ml LPS干预3 h后(3A)及10 μg/ml LPS干预0、1、3、6、9 h后(3B) LTC-14细胞α-SMA蛋白的表达

CP的临床表现主要为腹痛、脂肪泻和糖尿病，严重影响患者的生活质量[10]。CP确诊后20～25年的病死率为50%，并有4%的患者可发展为胰腺癌[11]。然而由于其发病机制尚不明确，目前尚无针对CP的有效药物，因此研究CP的发病机制迫在眉睫。

肠道细菌易位学说是解释胰腺炎发病机制的理论之一，该学说认为，正常情况下肠道内的细菌由于

表3 不同LPS浓度干预后LTC-14细胞ERK1/2通路相关蛋白表达量的变化

注：与0 mg/L组比较，aP<0.01

表4 10 mg/L LPS干预不同时间后LTC-14细胞ERK1/2通路相关蛋白表达量的变化

注：与0 h组比较，aP<0.05，bP<0.01

受到肠黏膜屏障的阻碍而难以易位到肠外组织，但在细菌过度生长、肠黏膜破坏的情况下，细菌可突破肠黏膜屏障而发生易位，易位的细菌除本身刺激细胞产生致炎因子外，革兰阴性细菌死亡或被吞噬后释放LPS进一步刺激机体免疫系统产生大量炎性因子，最终引发多脏器损伤[12]。

LPS引起的炎症反应有TGF-β1信号通路的参与。作为TGF-β1的核心信号通路，Smad通路与LPS引起的炎症反应关系密切[2-3]。大量研究表明，Smad通路在CP纤维化进程中也发挥重要作用[5-6]，但其在细菌易位方面的研究还未见报道。为此，本研究用LPS模拟肠道细菌突破肠黏膜屏障，采用不同LPS浓度及不同时间干预LTC-14细胞。结果显示，随着LPS刺激浓度的增加，Smad3表达逐渐升高，在10 mg/L时达峰值，其后逐渐降低；而Smad7蛋白的变化正好与其相反，LPS作用拐点的出现可能与高剂量LPS诱发了胞内的其他应激反应有关。而随着LPS干预时间的延长，Smad3表达逐渐升高，Smad7表达逐渐降低，表明Smad通路被持续活化，且活化程度不断提高。提示当有适量的细菌反复刺激时，胰腺产生的炎症反应会逐渐增强，这与细菌易位假说相呼应，可能是CP发生的病理基础。

细胞外信号调节激酶(ERK)为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的主要成员，至少包括ERK1和ERK2两个亚型。ERK通路参与应激、细菌产物和炎症递质等引起的细胞反应。研究证实，用细胞因子干预大鼠PSC可激活ERK通路，增加CX3CL1的释放；而阻断ERK1/2通路可抑制CX3CL1的分泌，表明PSC通过ERK1/2通路促进CP的发生[7]。在大鼠雪旺细胞实验中，LPS可以显著激活ERK1/2通路，进而诱导TNF-α的产生[13]。最近研究发现，LPS触发的炎性环境可抑制BMP-9的表达，并激活ERK1/2信号通路[14]。cPLA2作为ERK1/2通路的下游分子，是炎症反应的关键酶，cPLA2水解胞膜磷脂酸释放花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，AA 在环氧化酶2(cycloxygenase，COX)和脂氧化酶(lypoxygenase，LOX)进一步催化下生成前列腺素、 血栓素、白三烯以及ROS等物质，广泛参与炎症反应与氧化应激过程[8]。本研究结果显示，LPS干预PSC后可上调p-ERK1/2及其下游分子p-cPLA2的表达，并随着LPS干预时间的延长而逐渐升高；然而LPS干预并不影响ERK1/2蛋白的表达，表明LPS对ERK1/2通路的激活仅起到一个类似分子开关的作用，但激活程度不随LPS浓度的增加而变化，而是随着LPS干预时间的延长逐渐加大，与Smad通路效果类似。

PSC的活化在CP的发生和发展过程中起着关键的作用，PSC活化所致的胰腺慢性纤维化是CP和胰腺癌共同的病理经过，活化的PSC已经有望成为CP和胰腺癌治疗的一个新靶标[15-16]。有研究证明，Smad通路和ERK1/2通路都参与PSC的活化。在二丁基二氯化物(dibutyltin dichloride，DBTC)所致的大鼠CP中，Smad7表达显著降低，同时TGF-β1和α-SMA表达明显升高，PSC被广泛激活[17]。最近研究发现，ERK1蛋白在PSC的活化中发挥重要作用[18]，而α-SMA 表达是PSC激活的标志[19]。为了更直接地反映LPS对PSC的影响，本研究同样检测了α-SMA的表达变化。结果显示，低剂量LPS干预对PSC的α-SMA表达没有影响，中剂量LPS干预使α-SMA的表达逐渐升高，而高剂量LPS干预后α-SMA的表达未继续增加，表明中剂量LPS干预才能活化PSC，且随着LPS干预时间的延长而逐渐增加，与胰腺Smad通路和ERK1/2通路的效果类似。由此推测，PSC中LPS所致α-SMA的表达变化可能是通过Smad通路和ERK1/2通路实现的。

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(本文编辑：屠振兴)

The influence of LPS on the protein expression of related molecules in Smads and ERK1/2 signal pathway in LTC-14 cells

ZhangQing,ChenKai,LuMeili,XuWei,XiangXiaohui,XiaShihai,JiRunli.

DepartmentofGastrointerology,TianjinXiqingHospital,Tianjin300162,China

Objective To explore the influence of LPS treatment on related molecules in Smads and ERK1/2 signal pathway in pancreatic stellate cell line LTC-14. Methods LTC-14 cells were cultured in vitro, and were treated with LPS at different dose in different time points. Protein expressions of related molecules in Smads pathway and ERK1/2 pathway and α-SMA in LTC-14 Cells were examined by Western blot. Results On Treated LTC-14 cells by 0, 1, 5, 10, 20 and 50 mg/L LPS，protein expressions of Smad3 were 0.15±0.02, 0.37±0.02, 0.44±0.01, 0.46±0.02, 0.372±0.01 and 0.24±0.03; expressions of Smad7 were 0.79±0.05, 0.84±0.02, 0.55±0.03, 0.45±0.03, 0.34±0.02 and 0.92±0.07; p-ERK1/2 levels were 0.48±0.05, 0.74±0.03, 0.72±0.04, 0.89±0.02, 0.81±0.02 and 0.72±0.03; p-cPLA2 levels were 0.15±0.03, 0.30±0.01, 0.31±0.01, 0.30±0.02, 0.28±0.03 and 0.32±0.02; α-SMA levels were 0.56±0.06, 0.62±0.06, 0.54±0.04, 1.03±0.11, 1.39±0.08 and 1.28±0.10. The changes of protein expressions before and after LPS treatment were obvious (allP<0.01). The protein expressions of ERK1/2 were 0.56±0.03, 0.57±0.02, 0.53±0.02, 0.58±0.02, 0.59±0.05 and 0.55±0.04, which did not change obviously along with increased LPS dosages. LTC-14 cells treated with 10 mg/L LPS for 0, 1, 3, 6 and 9 h，the expressions of Smad3 were 0.69±0.05, 0.68±0.07, 1.02±0.14, 1.82±0.0 and 2.04±0.11，those of Smad7 were 2.77±0.10, 1.37±0.08, 1.45±0.14, 0.78±0.09 and 0.63±0.06，those of p-ERK1/2 were 0.16±0.03, 0.32±0.05, 0.79±0.03, 1.50±0.07 and 1.77±0.04，those of p-cPLA2 were 0.15±0.04, 0.32±0.06, 0.63±0.04, 0.95±0.04 and 1.49±0.10，those of α-SMA were 0.84±0.03, 1.26±0.21, 1.81±0.19, 4.28±0.26 and 4.37±0.15, all of which changed obviously as the treatment time increased (P<0.05 or 0.01). The expressions of ERK1/2 were 0.75±0.03, 0.72±0.02, 0.80±0.04, 0.74±0.03 and 0.85±0.09, which did not change obviously as the treatment time increased. Conclusions LPS could upregulate the expression of α-SMA in a time- and dose-dependent way, and activate intracellular Smads and ERK1/2 inflammatory pathways, which may be the potential molecular mechanism of the development of chronic pancreatitis.

Pancreas; Lipopolysaccharides; Astrocytes; Signal transductionFund program: Subject Foundation of Tianjin Xiqing Hospital(xqlx201401, xqlx201406); Seed-foundation of Affiliated Hospital of Logistics University of PAP(FYM201522); Startup Project of Doctor Scientific Research of Logistics University of PAP(WHB201515)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.02.005

300162 天津，天津市西青医院消化内科(张青)；武警后勤学院附属医院消化二科/肝胆胰脾中心(陈凯、卢美丽、许威、向晓辉、夏时海、冀润利)

冀润利， Email: base_19901s@163.com

天津市西青医院院级课题(xqlx201401，xqlx201406)；武警后勤学院附属医院种子基金(FYM201522)；武警后勤学院博士启动金(WHB201515)

2016-09-06)