三维生物打印技术概述：成像技术和打印技术

宋宇

木刻板印刷术的发明和后续15世纪工业化印刷术的发展使得文字和图像信息可以快速复制和广泛流传。可以说，印刷术对世界范围内的社会、教育、政治、宗教和语言起到革命性的影响。在过去的几十年内，印刷术已经从二维打印发展到连续层状叠加的三维打印。由三维（3D）打印而得到的复杂三维结构已经被快速地运用于大规模工业化生产和小范围的特定结构生产。而且，该技术作为一种理想的产业技术革新，在科学与教育上也拥有很大的指导作用。例如像华生和克里克在模拟DNA结构的时候所使用的球和棒模型，三维打印现在也被运用于复杂的生物细胞组织结构打印，不仅帮助人们认识相关的生物组织，也帮助人们进一步设计和开发新的具有功能意义的生物细胞组织结构。

三维打印由Charlies W. Hull提出。在这个被他成为“立体光刻”技术的中，材料薄层被逐层打出并且被紫外光固化，形成三维结构。这个制备过程后来被运用到用生物材料构成的三维支架的可降解的树脂模型中。后续发展的无溶剂液体基质的成型系统可以直接在打印三维生物材料所构成的支架中掺杂细胞。然后开发出的生物组织工程的三维生物打印技术则是三维打印技术，细胞生物学与材料科学这3个领域的交叉发展。比如在用三维打印技术构建一个用于临床的支架和夹板的运用。

在三维生物打印中，通过空间控制各个要素的打印信息逐层精确位置打印生物材料，生物化学物质和活细胞已构成三维结构。实现三维生物打印的方法有很多，包括生物仿生，自组装和采用微小组织构建单元。研究人员通过发展这些技术来完善打印各种具有功能性的人体组织单元来实现临床组织和器官功能的恢复。一个重要的挑战就是如何将溶胶状的塑料盒金属转变为生物相容性优良的生物材料。然而，核心挑战则是要复制重构出细胞外基质的微观环境结构以致于各种细胞可以在合适的环境下生长分化来重现生物功能。

笔者将集中讨论三维生物打印技术。现在三维生物打印技术发展出很多具体使用的制备方法，但是主要的核心制备方法还是分为3类，依次为生物仿生、自组装和微小组织结构单元。但是无论运用什么方法，都必须將成像技术和打印技术相结合来构件三维打印系统。

一、3种核心制备方法

1.生物仿生

生物工程已被应用于解决许多技术问题，包括飞行、材料研究、细胞培养和纳米科学技术。应用三维生物打印涉及制造细胞和细胞外组织的相同复制品。这可以通过复制具有特定细胞功能的组织组件。例如，模拟血管树的分支模式或制造生理上精确的生物材料类型和梯度。这种方法成功复制生物组织的关键在于微尺度的复制。因此，对于微环境的理解，包括功能和支持细胞类型的具体设计，渐变的可溶性或不溶性因素，细胞外基质的合成以及微环境生物内驱作用力都等都是必需的。对这一技术的发展将会对诸多技术领域，包括工程、成像、生物材料、细胞生物学、生物物理学和医学等各领域的发展起到巨大推动作用。

2.自组装体系

复制生物组织的另一种方法是使用胚胎器官发展作为参考。组织生长中早期细胞组件诱发相应的细胞外基质组件合成和分泌，并通过适当的细胞信号传递，产生自组结构合成和发展，来实现所需的生物微结构和功能模拟。“无支架”技术方法的使用使自组装细胞胞体进行融合和分裂来模仿自然组织的生成和发展。自组装体系依赖于细胞在组织生成的内在驱动力，来指导组织生成过程中相关组件的合成、分布、功能实现和结构支持。它需要一个类胚胎组织的发育机制和处理周围微环境的能力来推动三维生物打印技术在胚胎组织工程的运用。

3.微小组织构件

微小组织构件的概念是与以上2种所描述的三维打印技术息息相关的。器官和组织皆来源于小却功能完备的组织构件，或者微小组织构件。这些构件可以被定义为组织中最小的结构和功能构件，例如肾元。微小组织构件可以通过合理的设计，自组装或者这两者的结合来制造和组装成更大的器件。主要有2种方法：第一，自组装细胞胞体（类似于微小组织构件）使用生物仿生设计和合成组装到一个大规模的组织结构；第二，准确而细致地复制出一个组织结构单元可以被进一步设计并通过自组装发展成为有功能宏观组织结构。这些方法的例子包括血管构建块中通过自组装形成支血管来构件血管网络，和通过将三维打印技术和微流体网络技术相结合来构件用于各种药物和疫苗的筛选和体外疾病模型构件的“器官芯片”的构建。上面这些三维打印方法的组合可以实现打印一个复杂的具有多个功能，结构和机械性能和属性的生物三维结构。

生物打印过程主要有如下几个步骤：生物成像和设计，材料选择和细胞选用，以及相关组织结构的三维打印。在完成三维打印后，所得到的的人造组织可以进行移植，或者在某些情况下，经过一段时间的体外培养再移植，或者用于体外模型分析。

二、成像和数字化设计

要想对一个复杂异构且具有功能的组织和器官进行复制首要要求就是对这个复制组织的自然结构和功能进行充分的认识和理解。医学成像技术做为一种高效的不可缺少的三维信息获取技术，可以在细胞，组织和器官各个结构层面提供全方面的信息支持。这些先进的成像技术主要为非侵入式成像技术，包括断层扫描成像（Computed Tomography，CT），核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）。电脑辅助设计和电脑辅助制造（Computer-aided Design and Computer-aided Manufacturing，CAD-CAM）和数学建模也可以用来将断层分析扫描组织结构的信息数字化。

CT成像，用于诊断和介入分析，是基于不同组织对X射线的吸收程度不同而发展的技术。X射线源在照到物体对象时翻转，或者穿透照射对象的时候，技术设备中的传感器就会通过测量该变化后的X射线强度和传播角度，来作为组织信号的一个记录数据，体现了组织的一个微小结构，即体素。这个成像技术得到每一层的组织结构信息，通过合成和重组，则可以还原三维组织结构。

核磁共振成像具有为软组织提供空间高分辨率且增加对比度分辨率的图像信息的优点，同时可以极大限度地靠近成像组织而不会使目标组织过多地暴露于电离辐射的危害之下。核磁共振成像使用核磁共振：细胞内的生物分子多数都有核自旋现象，在一个强大的磁场中，组织的每一个小部分的核自旋磁场则在外加磁场的作用下重新排列。核能量状态的变化产生射频信号，而这一信号则可以被接收线圈测量。在适当使用对比试剂如钡或CT使用的碘和氧化铁，以及钆或金属蛋白可以极大地提高核磁共振扫描成像生物结构的对比度。这些对比增强试剂可以减轻X射线的强度或增强磁共振信号来对高度复杂的结构成像，例如血管，直接的成像很难将它们从周围的环境中分辨出来。

一旦获得原始图像数据，这些成像技术就会通过数据处理并利用层析重建分析来构件二维截面图像。三维剖析结构图则是将这些二维截面信息进一步分析或修改。这个过程被称为“分解剖析”向“合成剖析”的转变。使用CAD-CAM计算机三维建模和数学模拟技术是被广泛用来生成三维器官或组织结构的处理方法。三维剖析生成三维生物结构的观点认为，在同时保留图像体素的信息用于三维结构展现，描绘和成像是该技术三维图像的核心价值。重建图像或模型可以以多种方式来展现，包括轮廓栈、线框模型、阴影模型或固体模型与变量照明、透明度和反射率。

如果目标是要生成一个精确的组织和器官的图像，那么二维横截图或三维结构图可以直接运用于生物打印。虽然，直接复制一个病人自己的器官在工业生产中不会很理想（因为疾病和伤残导致器官的巨大差异）也不会很经济。但是这些成像技术则可以使这种为病人量体裁衣的精准治疗提供可能性。而且，用这些技术创立的模型还可以用来对该组织器官日后再机体内的机械和生物化学性能。目前，CT和MRI数据已经成为再生医疗领域提供数据支持主要实现技术，而这些技术数据也将为生物打印技术提供全方面的帮助。

三、组织生物打印方法

主要沉积和构型的生物材料制备技术包括喷墨，微挤出和激光辅助成型。基于对表面粗糙度，细胞存活率和可用于打印的生物材料的不同使用条件的要求，这些成型方法各自的优缺点都需要被仔细考虑。

1.喷墨打印

喷墨打印机（也被称为按需滴定打印机）是在生物样品和非生物样品成型时最经常使用的打印机。可控液体体积被输送到预先设定的打印位置。第1台运用于生物打印的喷墨打印机是基于商业二维墨基打印机的原型进行发展而得到的。在这个打印机中，墨盒中的墨水被可打印的生物材料取代，而纸张则变成可以提供Z轴方向（除了X和Y轴方向的第3维度）控制的电控升降打印平台。现在，墨基生物打印机可以按照不同客户在分辨率，精准度和速度各方面的具体需求处理并打印相关的生物材料。喷墨打印机是利用热的或声的驱动作用来将生物材料液滴打印在一个特定的材料基底上。

热喷墨打印机通过电加热打印头以产生迫使墨滴从喷嘴出来的压力脉冲而起作用。几个研究已经证明，该局部加热（其可以在200～300℃的范围内）对生物分子（例如DNA）的稳定性或对具有功能的哺乳动物细胞的存活率和后期培养不具有实质性影响。已经证明，加热的短持续时间（～2μs）导致打印机头中的总体温度仅升高4～10℃。热喷墨打印机的优点包括高的打印速度，低成本和广泛运用范围。然而，将细胞和材料暴露于热和机械应力，低液滴方向性，不均匀液滴尺寸，喷嘴频繁堵塞和不可靠的细胞封装的风险等这些相当大的缺点使得在3D生物打印中使用这些打印机还不是特别理想。

许多喷墨打印机包含压电晶体，其在打印头内部产生声波，以便以规则的间隔将液体破碎成液滴。向压电材料施加电压引起形状的快速变化，这又产生从喷嘴喷射液滴所需的压力。其他喷墨打印机使用与超声场相关联的声辐射力从空气-液体界面喷射液滴。可以调节超声参数，例如脉冲，持续时间和振幅，以控制液滴的尺寸和喷射速率。声喷墨打印机的优点包括产生和控制均匀的液滴尺寸和喷射方向性以及避免细胞暴露于热和压力应力源。另外，可以通过使用开放池无喷嘴喷射系统来避免施加在喷嘴末端壁处的细胞上的剪切应力。这降低了细胞活力和功能的潜在损失，并避免了喷嘴堵塞的问题。声学喷射器可以以可调节阵列形式组合成多个喷射器，以便于同时印刷多种电池和材料类型。即使如此，仍然存在一些关于压电喷墨生物打印机使用的15～25kHz频率以及它们诱导细胞膜损伤和溶解的可能性。由于使用较高粘度的溶液喷射液滴所需的过大的力，喷墨生物打印机也对材料粘度（理想地低于10cP）具有限制。

喷墨生物打印的一个常见缺点是生物材料必须是液体形式以便能够形成液滴；因此，印刷液体必须形成具有结构组织和功能的固体3D结构。这种限制可以通过使用在沉积后可以通过pH或紫外线机制的印刷而交联的材料来解决。然而，交联通常会减慢生物打印过程并涉及天然存在的细胞外基质（ECM）材料的化学改性，这改变了它们的化学和材料性质。另外，一些交联机制需要对细胞有毒性的产物或条件，其导致活力和功能性降低。基于喷墨的生物打印技术的用户遇到的另一个限制是难以实现生物相关的细胞密度。通常，低细胞浓度（少于1 000万细胞/mL）用于促进液滴形成，避免喷嘴堵塞和降低剪切应力。较高的细胞浓度也可以抑制一些水凝胶交联机制。

尽管存在这些缺点，基于喷墨的生物打印机还拥有许多优点，包括低成本，高分辨率，高速度和与许多生物材料的相容性。喷墨印刷的另一个优点是通过改变液滴密度或尺寸而在整个3D结构中引入细胞，材料或生长因子的浓度梯度。由于标准2D喷墨打印机的可用性，许多实验室的研究人员可以读取，修改和实验基于3D喷墨的生物打印技术。由于其简单的部件和容易获得的设计和控制软件，商业上可获得的喷墨生物打印机也是相对成本有效的。该技术由许多团体的广泛应用加速了喷墨生物打印机精确沉积具有均匀细胞密度的高分辨率和精确可控液滴尺寸的能力的进步。液滴尺寸和沉积速率可以电子控制，并且范围可以为<1pL至>300pL，体积比率为1～10 000液滴/s。已印刷了单个液滴的图案，每个液滴包含1～2个细胞，线宽约50μm。未来的进步将继续适应这种技术，以处理和沉积其他生物相关材料，以便于它们的印刷和提供组织的基本生物，結构和功能组件的方式。还必须解决额外的复杂性，例如对多种细胞类型和材料的需求。

喷墨生物打印方法的显著实例包括原位功能性皮肤和软骨的再生。该方法的高印刷速度使得可以将细胞和材料直接沉积到皮肤或软骨损伤中。这些应用通过生物相容性化学反应或光引发剂实现含细胞材料的快速交联，并通过将材料暴露于紫外光下进行交联。喷墨方法促进原代细胞或干细胞类型的沉积，其在整个病变体积中具有均匀的密度，并且在印刷后维持高细胞活力和功能。这些研究表明基于喷墨的生物打印再生功能结构的潜力。

使用静电纺丝和喷墨生物打印的组合也在体外制造了层状软骨构建体。混合电纺丝—喷墨生物打印技术使得制造支持细胞功能并保持合适的机械和结构性质的层状构建体的打印成为可能。喷墨生物打印机也已经用于制造骨骼构建体的制备，所构建的骨骼构建体在植入小鼠之前在体外发育到一定阶段，然后它们继续在体内成熟并形成与内源性骨组织具有相似密度的高度矿化的组织。

2.微挤出生物打印

最常见和负担得起的非生物3D打印机使用微挤出。微挤出生物打印机通常包括温度控制的材料处理和分配系统和阶段，其中1～2个能够沿着X、Y和Z轴移动，用于照射沉积区域的光纤光源和/或用于光引发剂激活，用于XYZ命令和控制的摄像机，以及压电加湿器。一些系统使用多个打印头来促进几种材料的串行分配，而无需重新装配。每年在全球销售近30 000台3D打印机，并且学术机构越来越多地在组织和器官工程研究中购买和应用微挤出技术。工业打印机相当昂贵，但是具有更好的分辨率，速度，空间控制能力和在它们可以打印的材料中的更大的灵活性。

微挤出打印机通过机械控制挤出材料来起作用，该材料通过微挤出头沉积到基底上。微挤出产生连续的材料珠而不是液滴。如CAD-CAM软件所指导的，在2个维度上沉积小的材料珠，阶段或微挤出头沿着z轴移动，并且沉积层用作下一层的基础。大量的材料与微型挤出打印机兼容，包括材料如水凝胶，生物相容的共聚物和细胞球体。挤压用于3D生物打印应用的生物材料的最常见方法是气动或机械（活塞或螺杆）分配系统。由于气动系统中的压缩气体体积的延迟，机械分配系统可以提供对材料流的更直接的控制。基于螺杆的系统可以提供更多的空间控制，并且认为有利于分配具有较高粘度的水凝胶，尽管气动系统也可以适合于分配高粘度材料。气动打印机具有具有更简单的驱动机构组件的优点，其力仅受系统的空气压力能力的限制。机械驱动机构具有更小和更复杂的部件，其提供更大的空间控制，但通常具有降低的最大力能力。

微挤出方法具有非常宽范围的流体性质，其与该方法相容，具有文献中描述的广泛的生物相容性材料。已经显示粘度范围为30mPa/s至>6×107mPa/s的材料与微挤出生物印刷机相容，其中较高粘度的材料通常为印刷构造提供结构支撑，而较低粘度材料提供合适的环境维持细胞活力和功能。对于微挤出生物打印，研究人员经常利用可热交联和/或具有纯粹稀薄特性的材料。几种生物相容性材料可以在室温下流动，这允许它们与其他生物组分一起挤出，但在体温下交联成稳定的材料。或者，在生理上合适的温度（35～40℃）下流动但在室温下交联的材料也可用于生物打印应用。具有剪切稀化性质的材料通常用于微挤出应用。这种非牛顿材料行为导致响应于剪切速率的增加而降低粘度。在生物制造期间存在于喷嘴处的高剪切速率允许这些材料流过喷嘴，并且在沉积时，剪切速率降低，导致粘度急剧增加。微挤出系统的高分辨率允许生物打印机准确地制造使用CAD软件设计的复杂结构并且促进多种细胞类型的图案化。

微挤压生物打印技术的主要优点是能够沉积非常高的细胞密度。在组织工程器官中实现生理学的细胞密度是生物打印领域的主要目标。一些组已经使用仅包含细胞的溶液以利用微挤出印刷创建3D组织构建体。沉积多细胞细胞球体并允许其自组装成所需的3D结构。组织球体被认为具有可以复制组织ECM的机械和功能性质的材料性质。根据结构单元的粘弹性性质，并置的细胞聚集体彼此融合，形成粘性宏观结构。自组装球体策略的一个优点是潜在地加速组织组织和指导复杂结构形成的能力。这种方法通过在3D生物打印的器官中通过图案化自组装血管组织球状体来显示在3D厚组织或器官结构中产生器官内支脉管树的希望。用于无支架组织球体生物打印的最常见的技术是机械微挤出。

微挤压生物打印后的细胞活力低于基于喷墨的生物打印；细胞存活率在40%～86%的范围内，随着挤出压力的增加和喷嘴规格的增加速率降低。通过微挤出沉积的细胞降低存活力可能源于粘性流体中施加在细胞上的剪切应力。分配压力可能比喷嘴直径对细胞活力具有更大的影响。尽管可以使用低压力和大喷嘴尺寸来维持细胞活力，但缺点可能是分辨率和打印速度的主要损失。保持高活力对于实现组织功能是必要的。虽然许多研究报告维持印刷后的细胞活力，研究人员证明这些细胞不仅生存，而且在组织构建中执行其基本功能是重要的。

增加打印分辨率和速度对于许多微挤出生物打印技术的用户是一个挑战。非生物微挤出打印机能够在10～50μm/s的线速度下分辨率为5μm和200μm。是否这些参数可以使用生物相关材料匹配，同时保持高细胞活力和功能尚待观察。使用改进的生物相容材料，例如动态交联的水凝胶，其在印刷期间机械稳定，并且在印刷后形成二次机械性能可能有助于在印刷后维持细胞活力和功能。单相、双相和连续级配支架也正在使用类似的原则设计。此外，喷嘴、注射器或电机控制系统的改进可以减少打印时间以及允许同时沉积多种不同的材料。

微挤出生物打印机已经用于制造多种组织类型，包括主动脉瓣，分支的血管树和体外药代动力学以及肿瘤模型。尽管对于高分辨率复杂结构的制造時间可能较慢，但是已经构建了从临床相关组织尺寸到微流体室中的微组织的构建体。

3.激光辅助生物打印

激光辅助生物打印（LAB）基于激光诱导的正向转移的原理。最初开发转移金属，激光诱导正向转移技术已成功应用于生物材料，如肽、DNA和细胞。虽然不太常见于喷墨或微挤出生物打印，但LAB越来越多地用于组织和器官工程应用。典型的LAB装置由脉冲激光束、聚焦系统，具有通常由被激光能量吸收层（例如，金或钛）覆盖的玻璃制成的供体传输支撑体的“带”在液体溶液中制备的生物材料（例如，细胞和/或水凝胶），以及面向带的接收基底。LAB使用聚焦激光脈冲在带的吸收层上产生将含细胞的材料推向收集器基底的高压气泡。

LAB的分辨率受许多因素影响，包括激光能量密度（每单位面积传递的能量），表面张力，基底的润湿性，带和基底之间的空气间隙，以及生物体的厚度和粘度层。因为LAB是无喷嘴的，所以避免了与其它生物打印技术困扰的细胞或材料堵塞的问题。LAB与一系列粘度（1～300Pa/s）兼容，可以打印哺乳动物细胞，对细胞活力和功能的影响可以忽略不计。LAB可以以高达108细胞/毫升的密度沉积细胞，使用5kHz的激光脉冲重复速率，每滴的单个细胞的微观分辨率，速度高达1 600mm/s。

尽管有这些优点，但是LAB的高分辨率需要快速的凝胶动力学来实现高的形状保真度，这导致相对低的总流速。对于每种印刷的细胞或水凝胶类型通常需要的每个单独的带的制备是耗时的，并且如果必须共同沉积多种细胞类型和/或材料，则可能变得繁重。由于带状细胞涂层的性质，可能难以精确地靶向和定位细胞。这些挑战中的一些可以通过使用细胞识别扫描技术来使激光束能够每个脉冲选择单个细胞来克服。这种所谓的“瞄准和射击”程序可以确保每个印刷的液滴包含预定数量的细胞。然而，统计细胞印刷可以使用具有非常高的细胞浓度的条带实现，避免了对这种特异性细胞靶向的需要。最后，由于在印刷期间金属激光吸收层的蒸发，金属残留物存在于最终的生物打印构造中。避免这种污染的方法包括使用非金属吸收层和改变印刷过程以不需要可吸收层。这些系统的高成本也是基本组织工程研究的关注，尽管与大多数3D打印技术的情况一样，这些成本正在迅速降低。

LAB用于制造细胞化皮肤构建体的应用证明了在层状组织构建体中印刷临床相关细胞密度的潜力，但是不清楚该系统是否可以按比例放大用于较大的组织大小。体内LAB已被用于在小鼠颅盖3D缺陷模型中沉积纳米羟基磷灰石。

在这些研究中，填充3mm直径、600μm深的颅盖洞作为概念的证明。激光3D打印已被用于制造医疗设备，例如定制、非细胞的、可生物再吸收的气管夹板，其被植入到具有局部气管支气管软化的年轻患者中。未来的研究可能使用可直接整合到患者组织中的材料。另外，并入患者自身的细胞可促进这些类型的构建体对组织的结构和功能组分都有贡献的适用性。

四、结语

经过以上阐述，读者可以对三维生物打印技术中的主要成像技术和打印技术有一个详细的了解。这些技术的发展得益于各个交叉学科的共同进步和发展，而三维生物打印技术则是将这些技术进行了系统性地整合和运用，使得它们可以更好地服务于人类社会关于精确治疗的这个大目标。在三维生物打印技术中所使用到的成像技术，很多都发源于医疗成像技术，也算是医学领域的延伸和发展。然而，打印技术却得益于工业技术的发展，它的发展却是与医学相关性很少。人们创新性地将2种技术相结合，用细胞及其生长组件作为打印材料，推出并发展三维生物打印技术可以算是产业和生命科学的完美结合。这其中所体现的并不只是科学的进步，更是人类智慧的结晶。随着医疗技术的深入发展，精确治疗已经成为人类社会对医疗领域的行业期许和专业要求。在这样的背景下，三维生物打印技术的蓬勃发展，一定可以为人类的医疗健康事业的高效安全可持续的发展提供巨大产业愿景和技术保障。