人睾丸蛋白SPAG4L与KASH结构域蛋白Nesprin-3的相互作用*

任瑶，伍勇，黄利华，邢晓为

(中南大学湘雅三医院a.医学实验中心，b.检验科，长沙 430013)

人睾丸蛋白SPAG4L与KASH结构域蛋白Nesprin-3的相互作用*

任瑶a,b，伍勇b，黄利华a，邢晓为a

(中南大学湘雅三医院a.医学实验中心，b.检验科，长沙 430013)

目的 探讨含SUN(Sad, UNC-84)结构域的人睾丸蛋白SPAG4L(sperm-associated antigen 4 like)与具有KASH(Klarsicht, ANC-1 and Syne homology)结构域的核膜血影重复蛋白3(nuclear envelop spectrin repeat proteins 3，Nesprin-3)之间的相互作用。方法 用生物信息学方法对SPAG4L蛋白进行分析，通过体外转染实验，观察SPAG4L的亚细胞定位；并用免疫荧光技术、免疫共沉淀和双分子荧光互补实验检测SPAG4L是否与KASH结构域蛋白Nesprin-3存在相互作用。结果 生物信息学分析结果表明，SPAG4L蛋白具有跨膜结构；亚细胞定位结果发现，SPAG4L蛋白定位于核膜和胞浆；免疫荧光、免疫共沉淀和双分子荧光互补实验结果表明，SPAG4L蛋白与Nesprin-3蛋白质相互作用，形成LINC(linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton)复合物。结论 SPAG4L与Nesprin-3 能够相互作用，形成LINC 复合物,对了解SPAG4L蛋白在精子发生中的作用具有重要的意义。

SPAG4L；核膜血影重复蛋白3；相互作用；LINC复合物；精子发生

SUN蛋白是近年来发现的一个新的核膜蛋白家族，共有5个成员：SUN1、SUN2、SUN3、SPAG4(sperm-associated antigen 4)和SPAG4L，其共同特征是C端包含一个保守的SUN结构域[1]。SPAG4L是SUN蛋白家族第5个成员，也称为SUN5或TSARG4(testis and spermatogenesis related gene 4)，由本课题组最先克隆并提交GenBank(AF401350)[2]。在前期研究中发现，在小鼠动物模式中，Spag4L在睾丸中特异性表达，受生长发育调控，参与精子减数分裂过程[3-4]。

核膜血影重复蛋白3(Nesprin-3)是一个KASH结构域蛋白。近年来研究发现，在睾丸滋养细胞中Nesprin-3介导中间纤维与核膜的连接[5]。在小鼠精子细胞中，Nesprin-3与 Spag4相互作用[6]。由于SPAG4L与SPAG4高度同源，本研究旨在分析SPAG4L和Nesprin-3的相互作用，为阐明SPAG4L在精子发生中的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系、仪器与试剂 人睾丸畸胎瘤细胞Ntera-2由本实验室保存；兔抗人Nesprin-3多克隆抗体(ab74261，英国Abcam公司)；小鼠抗人GAPDH抗体(1E6D9，武汉三鹰公司)；Cy3标记的羊抗兔IgG抗体(KGAB019，Keygen公司)；Flag标签抗体(AF519，Beyotime公司)；小鼠IgG(A7028，Beyotime公司)； 1640培养基和胰蛋白酶(美国Gibco公司)；pEGFP-SPAG4L重组质粒和pcDNA3.1(+)载体由本实验室保存；真核表达载体pCMV-C-Flag(D2632， Beyotime公司)；质粒抽提试剂盒、高保真酶(PrimeSTAR Max Premix)、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒和连接酶(日本TaKaRa公司)；限制性内切酶HindⅢ、XhoⅠ(美国Fermentas公司); DAPI染液(C1005，Beyotime公司)；Lipofectamine®2000 转染试剂(美国Invitrogen公司)；胎牛血清购(FS101-02，北京全式金公司)；Triton X-100(T8200, Solarbio公司)；琼脂糖(美国Invitrogen公司)；G418(e859，美国Amresco公司)；人睾丸cDNA为本实验室保存；PCR引物合成和质粒测序(上海生工公司)；PCR仪(美国ABI公司)；Eclipse 80i荧光显微镜(日本尼康公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 应用蛋白质结构预测分析网站ExPASy(http://www.expasy.org/proteomics)中TMHMM Server v.2.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)对SPAG4L的氨基酸序列进行生物信息学分析。

1.2.2 亚细胞定位 将Ntera-2细胞用胰蛋白酶消化后，按每孔1×105个接种于6孔细胞培养板中，待细胞融合率达80%时进行转染实验。转染步骤：4 μg pEGFP-N1-SPAG4L重组质粒和10 μL Lipofectamine®2000分别用不含血清的1640培养基稀释，静置5 min后混合，静置30 min，加入6孔细胞培养板(含Ntera-2细胞)中进行转染，5 h后更换含有血清的1640培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养 24 h，用0.01 mol/L PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤3次，每次5 min。DAPI染液(1∶2 000稀释)复染细胞核。在倒置荧光显微镜下观察出现,绿色荧光为SPAG4L的亚细胞定位。

1.2.3 SPAG4L与Nesprin-3的共定位 在6孔细胞培养板中铺上盖玻片，取上述转染后的Ntera-2细胞，按每孔1×105个接种，用1640培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定10 min，0.5% Triton X-100通透处理10 min，PBS洗涤3次，5% BSA封闭30 min。实验组用兔抗人Nesprin-3多克隆抗体(1∶200稀释)温育，对照组用5% BSA温育，均室温温育3 h，PBS洗涤3次，每次5 min。加入Cy3标记的羊抗兔IgG(1∶300稀释)室温温育1 h，PBS洗涤3次，DAPI复染细胞核，荧光显微镜观察红色荧光标记的Nesprin-3蛋白和绿色荧光标记的SPAG4L蛋白的定位，若Nesprin-3蛋白和SPAG4L蛋白能够共定位，红色荧光和绿色荧光叠加可出现黄色荧光。

1.2.4 免疫共沉淀实验 以人睾丸cDNA为模板，应用PCR扩增人SPAG4L基因(AF401350)开放阅读框。采用PCRDESN.EXE软件设计PCR扩增引物，正向引物序列：5′-CGAAGCTTATGCCACGGTCCTCAAGGAG-3′(HindⅢ 限制性酶切)，反向引物序列：5′-CGCTCGAGATCTCTCTTAGGGTAGGGGTTC-3′(XhoⅠ限制性酶切),扩增片段大小为1 153 bp。PCR反应体系：ddH2O 19 μL, 人睾丸cDNA 4 μL, 20 μmol/L上、下游引物各1 μL，PrimeSTAR Max Premix 25 μL。反应条件：95 ℃ 2.5 min；94 ℃ 30 s, 64 ℃ 30 s, 72 ℃ 1.5 min ，共35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。用PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化，然后按HindⅢ和XhoⅠ说明书操作进行双酶切反应，经10 g/L琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收酶切产物，并将回收的扩增片段克隆到pCMV-C-Flag载体，挑选阳性克隆，送上海生工公司进行测序，以验证插入片段是否正确，如果插入片段正确，则表示pCMV-C-Flag-SPAG4L重组质粒构建成功。用Lipofectamine®2000将pCMV-C-Flag-SPAG4L重组质粒按4 μg质粒∶10 μL Lipofectamine®2000的比例转染至Ntera-2细胞，培养24 h后用1 000 μg/L G418进行筛选实验。将筛选后的Ntera-2细胞用培养皿扩增，当筛选后的细胞融合度至80%～90%时，按照文献[7]方法裂解细胞、提取蛋白质并进行免疫共沉淀实验，对照组用小鼠IgG替代 Flag标签抗体进行实验。最后，用Flag、Nesprin-3和GAPDH特异性抗体对免疫共沉淀的产物进行 western blot分析[7]，以观察Nesprin-3蛋白是否能够被免疫沉淀。

1.2.5 双分子荧光互补实验(BiFC) 以人睾丸cDNA为模板，用PCR扩增SPAG4L和Nesprin-3的开放阅读框架， PCR扩增条件、反应体系、PCR产物纯化参照1.2.4提供的方法进行。参照文献[8]方法构建pcDNA3.1(+)-nesprin-3-YN 和pcDNA3.1(+)-SPAG4L-YC重组质粒，并对所插入的序列进行测序验证。按Lipofectamine®2000转染试剂说明书操作，将pcDNA3.1(+)-nesprin-3-YN 和pcDNA3.1(+)-SPAG4L-YC质粒同时导入到Ntera-2细胞作为实验组，以只转染了pcDNA3.1(+)-nesprin-3-YN或pcDNA3.1(+)-SPAG4L-YC质粒为对照组。转染48 h后，4%多聚甲醛固定转染后的细胞10 min， PBS洗涤3次，每次5 min。DAPI染液(1∶2 000稀释)复染细胞核，在荧光显微镜下观察结果，以黄色荧光表示二者存在直接相互作用。

2 结果

2.1 生物信息学分析结果 用ExPASy中的TMHMM Server v. 2.0软件对SPAG4L的序列进行分析，结果发现，SPAG4L有2个潜在的跨膜域(图1)，说明SPAG4L是一个跨膜蛋白。

注：红色代表跨膜域、蓝色代表内部、紫色代表外部，图中显示有2个潜在的跨膜域。

图1 TMHMM Server v. 2.0软件分析SPAG4L结果

2.2 SPAG4L的亚细胞定位 将pEGFP-SPAG4L重组质粒转入Ntera-2细胞中，培养24 h后发现，带有绿色荧光的SPAG4L融合蛋白在核膜和胞浆中均有分布，说明SPAG4L是核膜蛋白(图2)。

注： GFP-SPAG4L融合蛋白呈绿色荧光；细胞核呈蓝色荧光。

图2 SPAG4L亚细胞定位结果(×400)

2.3 SPAG4L与Nesprin-3共定位实验结果 免疫荧光实验结果显示，带有红色标记的Nesprin-3蛋白分布在核膜和胞浆中。该蛋白质能够与带绿色荧光的SPAG4L蛋白共定位发出黄色荧光，说明SPAG4L与Nesprin-3能够共定位(图3)。

2.4 免疫共沉淀实验结果 结果表明，Nesprin-3能够被免疫共沉淀下来，而对照组没有检测到Nesprin-3蛋白条带，表明在Ntera-2细胞中，SPAG4L能够与Nesprin-3蛋白质相互作用。内参GAPDH在各组细胞总蛋白中无没有明显差异(图4)。

注：绿色、红色、蓝色分别代表SPAG4L蛋白、Nesprin-3蛋白、细胞核的颜色，黄色代表SPAG4L和Nesprin-3共定位。

图3 SPAG4L和Nesprin-3共定位结果(×400)

注：A～C分别为用Nesprin-3、Flag以及GAPDH特异性抗体检测。TL，全细胞裂解液；anti-IgG，小鼠IgG阴性对照；anti-Flag，实验组。

图4 SPAG4L和Nesprin-3免疫共沉淀实验结果

2.5 双分子荧光互补实验结果 将pcDNA3.1(+)-Nesprin-3-YN 和pcDNA3.1(+)-SPAG4L-YC同时导入到Ntera-2细胞后，在细胞中出现了黄色荧光，而只转入pcDNA3.1(+)-SPAG4L-YC或pcDNA3.1(+)-nesprin-3-YN的细胞不产生荧光，说明SPAG4L与Nesprin-3之间存在直接相互作用(图5)。

注：蓝色代表细胞核颜色，黄色代表SPAG4L与Nesprin-3直接相互作用形成的黄色荧光蛋白。

图5 双分子荧光互补实验结果(×400)

3 讨论

SUN蛋白是近年来发现的一类新的核膜蛋白，SUN1、SUN2广泛分布在各种真核细胞中，而SPAG4和SPAG4L主要在睾丸中分布，与精子发生密切相关。近年来研究发现，SUN结构域蛋白SUN1、SUN2、SUN3、SPAG4能通过SUN结构域与具有KASH结构域的Nesprin-1，2，3等相互作用形成LINC复合物[1,7]，从而将细胞质骨架与细胞核骨架有机的联系起来。本研究证明了SUN蛋白家族的SPAG4L也能够与具有KASH结构域的Nesprin-3相互作用，形成新的LINC复合物。

目前蛋白质相互作用研究的方法包括pull-down、Co-IP、酵母双杂交和BiFC等技术[9]。本研究主要采用了Co-IP和BiFC技术。Co-IP实验主要是通过免疫学的方法证明在细胞内SPAG4L与Nesprin-3存在相互作用，这种相互作用可能是直接的也可能是间接的。BiFC实验揭示，如果SPAG4L和Nesprin-3直接相互作用，那么就使得SPAG4L和Nesprin-3所带的荧光蛋白的2个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发荧光。如果不是直接相互作用，那么二者空间距离太远则不能发出荧光。

Chalmel 等[10]发现，小鼠Spag4L基因是减数分裂的标志性基因，可能在精子发生减数分裂阶段发挥着重要的生理作用。Zhu等[11]发现人SPAG4L(SUN5)基因发生复合突变会引发男性无头精子症，导致男性不育。以上研究表明，SPAG4L蛋白在精子发生过程中发挥着重要的生理功能，SPAG4L异常会导致男性不育的发生。据此，我们推测SPAG4L与Nesprin-3相互作用形成的LINC复合物可能是SPAG4L在精子发生中发挥重要作用的分子机制之一。

Nesprin-3是含KASH结构域的Nesprins家族成员，近年来研究发现，Nesprin-3能够与SUN1η相互作用，在精子头部的形成中发挥着重要作用[12]。除了与SUN1η相互作用，Nesprin-3与SPAG4也能相互作用，例如在Spag4基因敲除的小鼠中，Nesprin-3定位发生改变，小鼠头部和尾部结构异常，出现雄性不育[6]。在前期研究中，我们发现SPAG4L与SUN1和SPAG4高度同源，尤其是SPAG4，两者可能来自同一个起源。本研究结果显示，SPAG4L也能与Nesprin-3相互作用，故而推测，SPAG4L与Nesprin-3形成的新的LINC复合物可能在精子头部形态的维护以及尾部的发育方面具有重要的功能。

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(本文编辑：许晓蒙)

Investigation on the interaction of human testis protein SPAG4L with KASH domain protein Nesprin-3

RENYaoa,b,WUYongb,HUANGLi-huaa,XINGXiao-weia

(a.CenterforExperimentalMedicineResearch,b.DepartmentofClinicalLaboratory,theThirdXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410013,Hunan,China)

Objective To investigate the interaction of human testis sperm-associated antigen 4 like(SPAG4L) protein containing Sad, UNC-84(SUN) domain with nuclear envelop spectrin repeat proteins 3(Nesprin-3) containing Klarsicht, ANC-1 and Syne homology(KASH) domain. Methods SPAG4L protein domains were analyzed with the bioinformatics method. After the SPAG4L plasmid was transfected into Ntera-2 cells, the subcellular localization of SPAG4L was observed. The interaction of SPAG4L with Nesprin-3 was determined by immunofluorescence, co-immunoprecipitation(co-IP) and bimolecular fluorescence complementation(BiFC) technology, respectively. Results Bioinformatics analysis results showed that there was a transmembrane structure in SPAG4L protein. Subcellular localization results demonstrated that SPAG4L protein located in the nuclear membrane and cytoplasm. Immunofluorescence, Co-IP, and BiFC results showed that there was an interaction between SPAG4L and Nesprin-3, and that a LINC(linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton) complex was formed. Conclusion SPAG4L may interact with Nesprin-3 to form a LINC complex, which is important for understanding the function of SPAG4L protein in spermatogenesis.

sperm-associated antigen 4 like; nuclear envelop spectrin repeat proteins 3; interaction; LINC complex; spermatogenesis

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.18

国家自然科学基金项目(81170615)；湖南省卫生厅项目(B2015-041)；中南大学研究生创新项目(2016zzts563)。

任瑶，1991年生，男，硕士研究生，主要从事分子诊断与基因功能研究。

邢晓为，副研究员，E-mail:davy2222@163.com。

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2016-12-30)