底泥得克隆污染在斑马鱼胚胎上的积累效应

周珊珊，应圣达，符 杰，金美青(.浙江工业大学 环境学院，浙江 杭州3004; .杭州电子科技大学 材料与环境工程学院，浙江 杭州 3008)

底泥得克隆污染在斑马鱼胚胎上的积累效应

周珊珊1，应圣达1，符 杰1，金美青2
(1.浙江工业大学 环境学院，浙江 杭州310014; 2.杭州电子科技大学 材料与环境工程学院，浙江 杭州 310018)

得克隆(Dechlorane plus, DP)是一种典型的多氯代阻燃剂，在大气、水、土壤和生物中都有检出，但是有关其在生物体中可积累性的研究仍十分匮乏.本实验以斑马鱼胚胎为模式生物，研究了吸附于底泥中的得克隆在斑马鱼体中的积累效应.结果表明：染毒底泥中斑马鱼胚胎的孵化率与空白样品均>90%,无显著性差异.目标化合物在底泥中染毒均匀，斑马鱼胚胎在染毒底泥中暴露192 h，得到的相应生物/底泥累积因子(BSAF)值，与DP高残留区所测值相当，但染毒水平对BSAF值的影响明显.斑马鱼体内DP的fanti值低于底泥，说明DP异构体在斑马鱼胚胎/幼鱼体内发生选择性积累或代谢.

底泥；得克隆；斑马鱼胚胎；积累效应

阻燃剂作为功能性助剂，它给予易燃物以难燃性，常被用于塑料、纺织品、表面加工和涂层等人造材料，其能够抑制、降低或延缓火焰燃烧，从而在一定程度上遏止火势的蔓延.得克隆(Dechlorane plus，DP)是上个世纪70年代开始生产的一种高氯代阻燃剂，与多种POPs(如氯丹、艾氏剂、狄氏剂、异狄氏剂、七氯等)具有类似的结构特征，因此随着DP产量及使用量的增加，有关其环境残留、生物积累能力及生态毒性的研究逐渐升温.已有研究表明：DP在大气、室内灰尘、土壤和沉积物等各类环境介质和生物体内均有检出[1-4].鉴于DP极高的疏水性(logKow=9.3)，底泥是该类化合物在水体中的主要分布相.通过水生生物吞食底泥或水生生物扰动导致底泥中的DP二次释放而积累至水生生物体内，是DP进入食物链的途径之一.研究表明：我国各河流流域及沿海地区的底泥中均检测到明显的DP残留，如松花江[5]，长江水系[6]，珠江水系[7]，黄、渤海海域[8]、珠江口地区[9]、胶州湾和套子湾[10]等.而部分有显著DP污染源的地区，如DP生产商Oxychem公司临近湖泊[11-12]以及我国的某电子垃圾拆卸地[13]，其底泥中的DP残留甚至高达1 990 ng/g干重.但是，目前有关底泥中DP生物积累效应的研究非常匮乏.

斑马鱼被广泛应用于生物积累及毒性实验，因其实验可行性高，结果反映准确真实.而鱼类早期发展阶段对化学物质特别敏感，再加上容易生产、照顾以及体型小的特点，非常适合化学分析.因此，斑马鱼胚胎进行生物积累及毒性试验已被建议作为进行风险评估时的替代方法.另外，斑马鱼胚胎试验允许高通量的分子筛选，节省了可观的时间和金钱.综上所述，以斑马鱼胚胎为模式生物，研究底泥中DP在水生生物中的积累效应，并对底泥中DP的生物可利用性以及可能的生态风险进行初步评价.

1 实验部分

1.1 实验试剂与材料

syn-DP(99.8%)和anti-DP(97.5%)标样购自美国Accustandard公司，DPMA(>98%)，αCl10DP(>98%)和αCl11DP(>98%)购自美国惠灵顿实验室(Wellington laboratories)，13C-PCB 141，13C-PCB 202和13C-PCB 208由美国剑桥同位素实验室(Cambridge isotope laboratories)提供.DP工业品(>95%)由江苏安邦电化有限公司[12]提供.无水Na2SO4(分析纯)、中性Al2O3(50～200 μm)和超纯硅胶(70～230目)在使用前分别经高温灼烧活化后置于干燥器中密封保存,其中无水硫酸钠的活化条件为在450 ℃下活化6 h，氧化铝在450 ℃活化4 h，超纯硅胶在180 ℃下活化12 h，所用有机溶剂均为色谱纯.

1.2 染毒底泥的制备

实验底泥取自安徽六安地区,经纬度(116°23′83.46″, 31°61′21.48″)底泥中有机碳的含量按照国标GB 07314，以元素分析仪测定.本实验所用底泥有机碳1.29%.

干法染毒：以丙酮溶解DP工业品配制质量浓度为500 mg/L的储备液，取适量储备液用丙酮稀释至20 mg/L用于染毒；将10 g石英砂平铺于500 mL烧杯中，用移液管移取5 mL染毒液缓慢滴于石英砂上使其浸没，将烧杯敞口置于通风橱中；待烧杯中丙酮挥发至约剩0.5 mL时，加入20 g底泥与石英砂混合，继续将170 g底泥分次加入烧杯进行搅拌；搅拌30 min后加入适当去离子水至粘稠适宜搅拌状态，置于自动搅拌器上搅拌72 h(每日检查含水状态)；搅拌完成后，置室温阴凉处自然风干，避光保存.染毒底泥中目标化合物包括syn-DP，anti-DP及anti-DP的一氯；二氯降解产物αCl11DP和αCl10DP，具体质量浓度，经方法1.4提取；净化后，以1.5所述方法测定.

1.3 斑马鱼养殖和暴露实验

选取中国科学院武汉水生生物研究所的性成熟斑马鱼，在本实验室条件下养殖、繁育.斑马鱼饲养于水温为(27±1) ℃，昼夜光照周期比为12 h∶12 h的水循环系统中.养殖用水需预先经过活性炭过滤(pH值7.2～7.6，硬度44～61 mg/L CaCO3).使用丰年虫饲养斑马鱼，喂食频率2次/d.

斑马鱼暴露实验方法主要参考GARCIA等[14]的研究，并加以改进.具体为：斑马鱼放置于产卵玻璃箱中产卵，并在同一天，取10 g染毒底泥均匀平铺于90 mm玻璃皿中，加入40 mL曝气充分的去氯水覆盖，室温下避光静置12 h，使底泥、孔隙水和上覆水三方达到平衡状态，用滴管吸取35颗胚胎均匀放置于染毒底泥的表层进行暴露实验.设置3个平行，每5个玻璃皿组成一个平行.玻璃皿置于(27±1) ℃，昼夜光照周期比为12 h∶12 h的环境中培养.暴露实验设置为静态系统，不喂食，不换水.每24 h往培养皿补充一次去氯水来保持水分总量不变.加水时沿培养皿壁逐滴添加，以防止其对培养皿内的底泥造成扰动.每天观察培养皿内斑马鱼生长状况，记录斑马鱼存活数量，在受精后192 h为发育终点.将每个平行组的斑马鱼收集于1.5 mL的离心管中，用移液枪充分吸干水分，记录湿重，储存于-20 ℃条件下待后续分析.用10 g空白土样代替染毒土样按上述方法得到空白鱼样.

1.4 样品的处理与净化

1) 底泥前处理[15].取2 g底泥于纤维滤筒中，加入示踪标13C-PCB 141和13C-PCB 208，Cu粉0.5 g，以120 mL二氯甲烷为提取溶剂索式提取48 h，控制提取频率在3～5次/ h；提取液经旋转蒸发浓缩、溶剂替换至0.5 mL正己烷；将浓缩后的提取液经氧化铝-硅胶复合层析柱净化，柱内填料从上至下为无水Na2SO4为2 g、活化中性Al2O3为3 g、活化中性硅胶为4 g和无水Na2SO4为2 g[16]，淋洗液为100 mL的V(正己烷)∶V(二氯甲烷)=7∶3的混合溶剂；将淋洗液在旋转蒸发仪中减压浓缩至约2 mL，以正己烷替换后再次浓缩至2 mL左右；将浓缩液转移至2 mL进样瓶中，氮气吹扫定容至1 mL，加入13C-PCB 202作内标，保存于-20 ℃条件下待GC-MS分析.

2) 鱼样前处理.将冷冻保存的鱼样解冻，加入500 μL超纯水，经超声波细胞破碎仪破碎(破碎程序设置：40%频率，运行4 s，暂停20 s)，暂停期间用冰冷却鱼样，重复破碎5次；鱼样破碎后转移至50 mL离心管中，加入示踪标13C-PCB 141和13C-PCB 208，向试管中加入8 mL混合V(正己烷)∶V(丙酮)=1∶1的混合溶剂，超声萃取[17]10 min，离心后收集上清液，重复萃取3次，并向萃取液中加入无水Na2SO4，过滤除水；除水后的萃取液经过旋转蒸发，以正己烷替换溶剂后浓缩至2 mL左右，将浓缩液通过有机滤头过滤；用柔和的氮气吹扫定容至1 mL，加入内标13C-PCB202，保存于-20 ℃条件下待GC-MS分析.

1.5 仪器分析

样品的定量分析用气相色谱-负化学电离-质谱联用法(Agilent 7890 GC / 5973 MS)测定，所用的气相色谱柱为DB-5HT(15 m × 0.25 mm，0.25 μm)毛细管柱.

1) 色谱条件.进样口的温度设定为280 ℃，进样方式为不分流，载气为高纯氦气，载气流量为1.0 mL/min，进样量为1 μL；升温程序：初始温度为100 ℃，先以10 ℃/min升温至250 ℃，再以3 ℃/min升至280 ℃，最后以20 ℃/min升至320 ℃并保持5 min.

2) 质谱条件.传输线、离子源和四级杆的温度分别设定为280，150，106 ℃；质谱离子源选用负化学离子化电离源，以甲烷作为反应气，在选择离子模式(SIM)下进行定量分析；DP的两个同分异构体syn-DP和anti-DP的m/z为653.8/651.8，anti-DP的一氯、二氯降解产物αCl11DP，αCl10DP的m/z分别为619.7/617.7和583.9/581.9，示踪标13C-PCB141和13C-PCB208的m/z分别为372.0/370.0和475.8/473.8，内标物13C-PCB 202的m/z为441.8/439.8.

1.6 质量控制与保证

采用内标法定量，各目标物标准曲线的相关系数均>0.999，内标物和目标物的仪器信号响应相关系数均>0.995.以质谱响应为10倍信噪比所对应的目标物含量作为实验的方法检出限，得到目标物syn-DP，anti-DP，αCl10DP和αCl11DP对底泥样品的方法检出限分别为0.43，0.49，0.54，0.29 pg/g(以干重计)，对斑马鱼样品的方法检出限分别为0.037，0.049，0.024，0.045 ng/g(以湿重计).本研究在测定斑马鱼样品和底泥样品前，以等量的无水Na2SO4代替底泥作为空白样品，每处理6个样品测定1次实验室空白值，只测得anti-DP有少量的实验室空白，均<0.3 ng/g(以干重计).本研究的目标物syn-DP，anti-DP，αCl10DP，αCl11DP和示踪标13C-PCB 141和13C-PCB 208在底泥样品中的染毒回收率分别为(98±11)%，(105±8)%，(92±13)%，(95±14)%，(95±8)%，(96±5)%，在斑马鱼样品中的染毒回收率分别为(82±9)%，(93±6)%，(76±10)%，(79±11)%，(79±8)%，(82±3)%.

2 实验结果与讨论

2.1 得克隆工业品对斑马鱼胚胎孵化率的影响

表1显示了斑马鱼胚胎暴露于染毒底泥以及空白底泥中192 h后，三个平行实验的胚胎孵化情况.空白底泥与染毒底泥对比发现，斑马鱼胚胎的平均孵化率都在90%左右，说明对胚胎均无明显急性毒性，实验浓度设置合理.胚胎的少量死亡可能是鱼本身排泄物对溶液的污染造成的[18]，也可能是生物适应环境的表现[19].

表1 空白及染毒底泥斑马鱼胚胎孵化率比较

Table 1 Comparison of zebrafish embryos hatchabilities in the blank and DP-spiked sediment

参数实验组暴露组对照组孵化个数/胚胎总个数154/175167/175160/175163/175161/175167/175孵化率1)/%90.47±1.2195.03±1.67

注：1) 3个平行样品的孵化率均值±标准偏差.

2.2 得克隆工业品在斑马鱼幼鱼体内的富集效应

2.2.1 得克隆工业品组成

图1为质量分数10-8的得克隆工业品GC-MS图.从图1可以看出：得克隆工业品中m(syn-DP)∶m(anti-DP)接近1∶4.这与之前报道[15]提及的中国DP生产厂家的DP工业品m(syn-DP)∶m(anti-DP)=2∶3有所差异.此外，得克隆工业品还存在一定量的αCl10DP和αCl11DP.αCl10DP和αCl11DP也可能是生产DP的过程中副产物或是DP储存过程中降解导致的[20].

syn-DP和anti-DP的结构式分别为

图1 得克隆工业品GC-MS图Fig.1 GC -MS for the commercial product of DP

2.2.2 底泥染毒效果检测

检测底泥染毒效果，在染毒底泥中syn-DP，anti-DP，αCl10DP，αCl11DP的质量分数分别为(120±3.6)，(500±15.5)，(8±0.16)，(30±0.42) ng/g(以干重计)，fanti=0.80.表2列出了从染毒底泥随机3个位置，编号为A，B，C点取出的染毒底泥萃取净化分析后的结果.每个取样位置设置两个平行.表2所示结果是在原来质量浓度的基础上稀释20倍进样得到的.

表2 染毒底泥染毒效果分析表

Table 2 Distributions of DP and its related compound in the spiked sediment

底泥污染物检出质量浓度/(μg·L-1)αCl10DPsyn-DPαCl11DPanti-DP样本A11.5012.362.9149.32样本A21.5413.953.1453.87样本B11.5113.983.3553.64样本B21.5913.713.2753.22样本C11.5113.442.8452.47样本C21.5312.813.0849.47

2.2.3 斑马鱼对底泥各目标物的积累效应

经过192 h的暴露，染毒组斑马鱼幼体体内同时检测到syn-DP，anti-DP，αCl10DP和αCl11DP四种化合物，而空白组仅测到syn-DP和anti-DP.各化合物在鱼体内的质量分数水平和相应的生物/沉积物富集因子(BSAFs)见表3.

经过192暴露后，所有染毒组中的斑马鱼体内富集的各目标化合物质量分数相差较大，anti-DP富集量最大，达到(36.84±4.28) ng/g(以湿重计)，syn-DP其次，为(11.93±1.61) ng/g (以湿重计)，而αCl11DP和αCl10DP的富集量分别为(2.05±0.23)ng/g(以湿重计)和(0.73±0.04) ng/g(以湿重计).暴露于空白底泥中，幼鱼体内syn-DP和anti-DP质量分数分别为(1.49±0.25) ng/g(以湿重计)和(3.24±0.18) ng/g(以湿重计).与空白组相比，在染毒底泥暴露后的鱼样中syn-DP和anti-DP分别为前者的8倍及10倍，且αCl10DP和αCl11DP也有相当质量分数的积累，说明这四种化合物可经由底泥进入斑马鱼胚胎内.我组之前的研究[21]用Tenax-TA法测定沉积物中syn-DP，anti-DP，αCl10DP和αCl11DP的快解析速率常数Krap在0.071～0.091 h-1，与BDE-209的Krap值相当0.076 h-1[14]，暗示本实验所涉及得克隆及相关化合物与BDE-209的生物可利用性相当.

通过计算BSAF值得到：anti-DP(0.013)，syn-DP(0.018)，αCl10DP(0.017)和αCl11DP(0.012).该数据与DP高残留地区(底泥中syn-DP和anti-DP的有机碳质量分数分别为(13 100±2 880)，(55 300±7 140) ng/g三种底层鱼类(鲫鱼、鲮鱼、黑鱼)体内所测BSAFs具有可比性(<0.06)[22].据Wong等[23]研究，在高残留区，由于DP异构体在底泥和鱼之间未达到分配平衡，可能导致该地区的BSAF值低估该化合物实际的生物可利用性.另外，空白底泥中也有syn-DP和anti-DP检出，其残留质量分数分别为(0.14±0.02)，(0.51±0.09) ng/g(以干重计).因此，我们进一步评价了暴露于空白底泥斑马鱼胚胎对DP异构体的积累效应.计算所得anti-DP和syn-DP的BSAF值均值分别为1.93和1.15.此结果与DP在其较低残留区所测BSAFs值相近.比如，Shen等[24]测得，DP在美国安大略湖地区(底泥中总DP的质量分数均值为110 ng/g，以干重计)底泥-鲑鱼间的BSAFs均值约为0.6.Jia等[25]测得采集于中国北方海岸(底泥中syn-DP和anti-DP的质量分数分别为(1.3±1.5)，(1,6±1.4) ng/g，以干重计)的牡蛎样品中DP的BSAFs均值约为4.6.以上结果表明污染物的质量分数对底泥中DP生物可利用性有一定的影响.

从表3中得出：斑马鱼胚胎在染毒底泥暴露的192 h后，DP的fanti由得克隆工业品中平均值为0.80变为斑马鱼体内的平均值0.76.这可能由DP异构体在斑马鱼体内的选择性积累或代谢造成.2007年，Tomy等[26]发表了关于DP在水生生物中蓄积情况的研究报道，将来自北美五大湖区域温尼伯湖和安大略湖的几种鱼类进行检测分析，发现DP的两种异构体在温尼伯湖鱼类中的生物积累具有选择性，anti-DP主要在高营养级的鱼类中积累，而syn-DP则主要在低营养级的鱼体内积累，也就是说随着营养级的升高anti-DP更有可能进行生物放大作用，或是syn-DP更容易被生物降解.本研究发现斑马鱼幼鱼体内syn-DP浓度更高，与Tomy等[26]的研究结果一致.但Wu等[27]]的研究则发现中国南部电子回收垃圾场附近的水库中，低营养层的生物较易富集anti-DP，而高营养级生物体内则更容易富集syn-DP.之前的研究[28]表明了化合物同分异构体生物积累选择性上的差异可由选定生物的食性、生境和所处营养级有关，同时t检验表明了αCl10DP和αCl11DP在各目标物中分别所占比例在暴露前后没有显著差异(P>0.05).

表3 各处理组斑马鱼体内各目标物含量及BASFsTable 3 Concentrations of DP and its related compounds in zebrafish exposed in the blank and spiked sediments

3 结 论

本实验所用批次的得克隆工业品由syn-DP，anti-DP，αCl10DP和αCl11DP组成，anti-DP占总DPs的比例接近80%.syn-DP，anti-DP，αCl10DP和αCl11DP在染毒底泥中分布均匀，染毒质量分数分别为(120±3.6)，(500±15.5)，(8±0.16)，(30±0.42) ng/g(以干重计).该浓度与得克隆高污染区底泥中DP的残留水平相当，且未明显影响斑马鱼胚胎的平均孵化率.暴露于染毒底泥的斑马鱼体内syn-DP，anti-DP，αCl10DP，αCl11DP的质量分数分别(11.93±1.61)，(36.84±4.28)，(2.05±0.23)，(0.73±0.04) ng/g(以湿重计)，说明底泥中这四种化合物具有一定的生物积累能力.计算所得BSAFs值与环境高污染区相当，比较结果表明：污染质量分数是影响底泥中DP及相关化合物的生物可利用性的重要影响因素，DP异构体在斑马鱼胚胎/幼鱼体内发生选择性积累或代谢.

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(责任编辑：刘 岩)

Bioaccumulation of sediment-sounded dechlorane plus in zebrafish embryos

ZHOU Shanshan1, YING Shengda1, FU jie1, JIN Meiqing2
(1.College of Environment, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China；2.College of Material and Environmental Engineering, Hangzhou University of Electronic Scienceand Technology, Hangzhou 310018, China)

Dechlorane plus (DP) is one of typical chlorinated flame retardants, which can be detected in many environmental media such as atmosphere, water, and soil, as well as biological samples. However, the researches about the bioavailability of DP are relatively scarce. In the present manuscript, the bioaccumulation capacity of sediment-bounded DP into zebrafish embryo was studied. The results include: The hatchabilities of zebrafish embryos in the blank and spiked sediment were comparable and both higher than 90%. zebrafish embryos in infected 192 h exposure in the sediment,the results of their biota/sediment (BSAF) in zebrafish embryos we studied were comparable to those reported in high DP-polluted areas. However, the bioaccumulation capacities of DP were significantly influenced by the contaminant levels. Moreover, the varies offantibetween sediment and zebrafish suggested that the bioaccumulation and/or metabolism of DP in zebrafish embryos/juveniles were isomeric selective.

sediment; dechlorane plus; zebrafish embryos; bioavailability

2016-03-19

国家自然科学基金资助项目(21377117，21407038)；浙江省自然科学基金资助项目(LY13B070006,LQ14B070006)

周珊珊(1981—)，女，浙江慈溪人，副教授，研究方向为持久性有机污染物环境归趋及生态毒理，E-mail:sszhou@zjut.edu.cn.

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1006-4303(2017)02-0200-06